人工老化对老芒麦种子生理生化特性及醇溶蛋白组成的影响

孙守江，祁 娟，金 鑫，吴召林，何丽娟，陈永岗，王 波，师尚礼

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

种子是农业生产中的重要资料，种子收获后保存、储藏过程中内部的各种物质不断的被消耗，因此，种子在储藏过程中随着储藏年限的增加活力不断降低，不可避免的出现老化现象[1-2]。因此，需采取外界措施延缓种子代谢过程，减少重要物质的丢失。种子内部无休止的发生着一系列的生理生化反应，贮藏环境不良将导致大量活性氧积累，进而引起一系列的生理生化特性变化，如抗氧化酶活性降低、细胞膜脂被氧化、细胞膜透性变大、代谢产物外渗，而较高浓度的活性氧对细胞遗传物质、蛋白质造成氧化损伤[3]。因此，贮藏环境直接影响着种子的遗传物质、贮藏物质，反应产物同时也影响细胞的结构，种子内部各种酶的活性进一步又反馈调节生理生化反应的速度[4]。随着对种子老化研究的深入，许多学者开始运用人工加速种子老化的方法，通过对老化种子活力及生理生化变化的研究，找出活力下降的原因和某些生理生化特性的变化规律，进一步探讨种子老化的机理。人工加速种子老化是在人为条件下对种子进行加速老化处理使种子活力迅速丧失的过程[5]，可在短时间内研究在自然条件下需要很长时间才能产生的劣变过程，是研究种子劣变规律的有效途径[6]。利用人工老化法使种子活力迅速丧失，可模拟种子的自然老化和劣变过程[7]。刘霞[8]、孙春青[9]、曾钦薇等[10]采用人工加速老化方法，分别研究了辣椒种萼香茶菜种子、2个玉米自交系(Mo17、478)种子、茶叶籽、垂穗披碱草种子、越冬甘蓝品种‘冬升’种子、油菜种子老化过程中发生的一系列生理变化。吴浩等[11]采用人工种子老化的方法制得不同活力的垂穗披碱草种子，研究了垂穗披碱草种子活力及其与酶和贮藏蛋白的关系，研究发现，人工老化不仅对种子的活力以及生理生化特性有影响，还对种子内部的贮藏蛋白质也有影响。

醇溶蛋白作为种子储藏蛋白的一部分，在种子活力的维持方面发挥着重要作用[11]，为种子萌发初期提供必需的结构物质，使得种子正常发芽。在发育过程中，其组成不受自身以及周围直接接触环境的影响，其电泳谱带特征全部受到对应的遗传物质调控[12]，因此，可以通过观察电泳谱带了解相关基因的特异性表达情况，探讨人工老化对醇溶蛋白组成的影响。

老芒麦(Elymussibiricus)是禾本科披碱草属多年生草本植物，在中国广泛种植[13]。老芒麦种子作为中国北方地区主要的栽培及生态建设使用草种之一[14]，其种子产量高低尤其是种子质量优劣受到生产者以及经营者的高度关注[15]。在农业生产、人工草地建植以及天然草地恢复中经常会用到已存放很久的种子，前期种子存放不当会使种子的萌发力下降，在田地种植以后导致出苗不佳，给农业生产以及人工草地建植造成损失[16]。基于此，以老芒麦种子为材料，研究人工老化处理后种子的生理生化变化，并采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳法(A-PAGE)对不同老化程度种子醇溶蛋白进行分析，以期为评价种子的品质好坏提供理论依据，为延缓种子老化过程提供参考资料，也对老芒麦资源的进一步开发利用具有积极的意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为‘青牧1号’老芒麦(Elymussibiricus)种子，2015年9月10日采集于青海省畜牧兽医科学院海北州海晏县西海镇牧草种子扩繁试验基地，该基地位于E 100°23′，N 36°44′，海拔3 010 m。收集的‘青牧1号’老芒麦种子用布种子袋分装，室温贮藏于青海省畜牧兽医科学院牧草种子库中。试验于2017年10～12月在甘肃农业大学草业学院实验室进行。

1.2 试验方法

1.2.1 老芒麦种子老化处理方法 随机选取供试种子，参照国际种子检验协会提供的种子老化方法[19]，用种子老化箱IH-150S对种子处理，即在45℃，100%相对湿度条件下进行人工老化处理。老化处理时间分别为0(对照CK)、1、2、3、4、5、6和7 d，以不处理的种子为对照。老化后的种子随机取出在室温条件下晾干(3～4 d)[20]，4℃保存备用。

1.2.2 生理生化指标测定 种子浸出液电导率测定参照国际种子检验协会《种子活力测定方法手册》有关电导率测定方法，用DDSJ-308A电导仪测定浸出液电导率[μs/(cm·g)][23]，随机选取老化处理后的饱满种子50粒，重复3次，称量后放入100 mL去离子水中，设置对照(100 mL去离子水)，加盖在20℃恒温培养箱中放置24 h；丙二醛(MDA)含量的测定参考文献[20]的方法；过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法[20]；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用NBT光还原法[29]；可溶性糖含量的测定用蒽酮法测定[20]；可溶性蛋白含量测定用考马斯亮蓝G-250染色法[20]。

1.2.3 醇溶蛋白提取及酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)分析 醇溶蛋白的分离鉴定采用国际种子检验协会(ISTA)颁布的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE) (pH 3.12)标准程序[25]，并加以改进。醇溶蛋白提取液：依次吸取25 mL 2-氯乙醇、5 mL丙三醇，用蒸馏水定容至100 mL，低温保存；电极缓冲液，取4 mL冰醋酸，加入0.4 g甘氨酸，用蒸馏水定容至1 L，低温保存；凝胶缓冲液，1.0 g 氨基乙酸(Glycine)，60 g尿素，1.0 g抗坏血酸，硫酸亚铁0.05 g，20 mL冰醋酸，用蒸馏水定容至1 L；凝胶溶液：17.55 g丙烯酰胺，0.45 g亚甲基丙烯酰胺，用凝胶缓冲液溶解并定容至100 mL；0.6%过氧化氢液：取2 mL 30%过氧化氢，用蒸馏水定容至100 mL；10%三氯醋酸液，取50.0 g三氯醋酸，用蒸馏水定容至500 mL；1%考马斯亮蓝液：取0.5 g考马斯亮蓝R-250，用无水乙醇溶解并定容至50 mL；甲基绿指示剂，取0.05 g甲基绿，用蒸馏水溶解并定容至100 mL。

醇溶蛋白提取：每份材料取6粒，去芒剥皮研成粉末后转入1.5 mL离心管中，加入1 mL醇溶蛋白提取液，摇床震荡提取1 h，室温下浸提过夜，8 000 r/min离心5 min，将上清液转入新的1.5 mL离心管中，并加入30 μL甲基绿指示剂，混匀后染色30 min立刻上样或于4℃保存备用。

电泳检测：(1)灌胶 吸取30 mL凝胶溶液，加入46 μL 0.6%过氧化氢溶液，迅速摇匀后倒入凝胶玻璃板之间，插入样品梳，静置至凝胶完全聚合；(2)待凝胶完全聚合后，小心取出样品梳，用电极缓冲液冲洗加样孔，每个样品加样量为10 μL；(3)电泳在冰盒中进行，上下电泳槽中加入电极缓冲液800 mL，先100V预电泳10 min，待样品全部进入胶板后，电压调至300 V，电泳110 min；(4)电泳结束后，待玻璃板完全冷却至室温，取下凹型玻璃板，每块胶板取200 mL 10%三氯醋酸并加入10 mL 1%考马斯亮蓝液混匀，固定染色12 h后用蒸馏水冲洗干净并拍照。

1.2.4 数据处理 用SPSS 20.0 软件进行统计分析，Microsoft Excel 2016软件整理数据并绘图，所有数据均为3个重复的平均值±标准误(±SE)。

2 结果与分析

2.1 人工老化对老芒麦种子生理生化特性的影响

2.1.1 人工老化对老芒麦种子浸出液电导率和MDA含量的影响 随着人工老化程度的加剧，种子浸出液电导率和MDA含量都呈现出一个逐渐增加的趋势。老化7 d后，种子浸出液电导率与对照相比差异显著(P<0.05)，增幅为13.9%；老化1～4 d处理间差异不显著(P>0.05)，5～7 d处理间差异显著(P<0.05)(图1)。人工老化处理显著增加了脂质氧化终产物MDA的含量。随老化时间的延长，人工老化1～3 d，MDA含量缓慢上升，老化处理3 d后MDA含量开始显著增加，增幅为109.21%，第7 d达最大值，与对照相比，MDA含量增加54.97 μmol/g(图2)。

图1 人工老化处理下老芒麦的电导率Fig.1 Changes of conductivity in Elymus sibiricusafter artificial aging treatment注：图中不同字母表示不同老化时间之间差异显著(P<0.05),下同

2.1.2 人工老化对老芒麦种子可溶性蛋白和可溶性糖的影响 随着老化时间的延长，可溶性蛋白含量呈现先上升后下降的趋势。与对照相比，老化1 d后可溶性蛋白含量增加2.43 mg/g，随着老化程度的进一步加剧，可溶性蛋白含量开始缓慢降低，老化3 d后，可溶性蛋白含量急剧下降，通过显著性分析可以看出，不同处理之间差异显著(P<0.05)，老化7 d后，可溶性蛋白含量与对照相比下降了11.89 mg/g(图3)。老化处理后，与对照相比，可溶性糖含量增加，增幅为79.05%，但是各处理之间差异不显著(P>0.05)(图4)。

图2 人工老化处理下老芒麦的MDA含量Fig.2 Changes of malondialdehyde content in Elymus sibiricus after artificial aging treatment

图3 人工老化处理下老芒麦的可溶性蛋白含量Fig.3 Changes of soluble protein content in Elymus sibiricusafter artificial aging treatment

2.1.3 人工老化对老芒麦种子SOD和POD活性的影响 随着老化程度的加剧，SOD活性呈明显下降趋势，第7 d下降至最低点，与对照相比，SOD活性下降了44.49%，不同处理的老芒麦种子SOD活性与对照相比差异均显著(P<0.05)(图5)。随着老化程度的加剧，POD活性同样呈现出下降趋势，老化初期，下降较平缓，老化处理2 d后，POD活性显著降低，老化处理第7 d下降至最低点，与对照相比，活性下降了32.62%。不同处理与对照相比差异均显著(P<0.05)(图6)。处理相同天数，SOD活性下降程度大于POD活性下降程度(44.49%>32.62%)。

图4 人工老化处理后老芒麦的可溶性糖含量Fig.4 Changes of soluble sugar content in Elymus sibiricus after artificial aging treatment

图5 人工老化处理老芒麦的SOD活性Fig.5 Changes of SOD activity in Elymus sibiricus after artificial aging treatment

图6 人工老化处理后老芒麦的POD活性Fig.6 Changes of POD activity in Elymus sibiricus after artificial aging treatment

2.2 人工老化对老芒麦种子醇溶蛋白组成的影响

处理0～2 d的条带最多，为16条，3～5 d的条带最少，为9条。参照Woychick J H等[32]的方法，根据迁移率大小将电泳谱带分为α、β、γ 和ω 4个区，不同老化程度的种子在各个分区中出现的谱带数目有所不同(表1)。当人工老化4 d以后，醇溶蛋白图谱颜色逐渐变浅，且随着人工老化时间进一步延长，α、β、γ 和ω4个区的醇溶蛋白谱带表现为缺失或消失(图7)。

图7 醇溶蛋白电泳图谱Fig.7 Electrophoretogram of gliadin under different aging treatments注：1,2,3,4,5,6,7表示不同的老化天数；CK表示未老化的种子

老化天数/d总谱带数分区谱带数αβγω0(CK)1653531165353216535339422149422159422161042317104231

3 讨论

3.1 人工老化对老芒麦种子生理生化特性的影响

种子收获后在合适的环境下可以贮藏，但是随着贮藏条件不佳以及贮藏时间的延长，种子将会不断的劣变，种子老化将不可避免、不可逆转的发生。种子老化或者劣变是一个逐步发生并且涉及众多复杂生理生化反应的过程，老化过程中表现出抗氧化酶活性逐渐降低、细胞膜脂被氧化、细胞膜透性变大、代谢产物外渗等，人工老化是模拟自然老化的过程[17]。

MDA 通常作为膜脂过氧化的产物之一，此含量的高低可以用来衡量植物处在逆境胁迫下细胞膜受损的程度[29]。试验中随老化程度的加剧，种子的MDA含量逐渐升高，这与Zhang M等[29]在玉米种子人工老化研究中的结果一致，说明人工老化处理加速了细胞膜的受损程度。随着老化时间的延长，种子浸出液电导率逐渐升高，说明细胞膜破坏越来越严重。

可溶性糖是种子光合作用前的底物，能反应呼吸底物的丧失，也能反应种子在老化中的损伤程度以及种子活力的高低[28]。随着老化程度的加重，老芒麦种子的可溶性糖含量逐渐增加，这与Kalpana[26]和浦心春等[28]的研究结果相似，说明随着老化程度的加剧，细胞膜结构可能受到破坏。可溶性蛋白作为一种重要的细胞渗透调节物质，在植物适应逆境胁迫过程中发挥着重要作用，随着老化时间的延长，老芒麦种子的可溶性蛋白含量逐渐降低，这与孔治有等[1]在小麦种子老化研究中得出的结论一致，可能是由于细胞膜受到严重破坏导致可溶性蛋白的含量降低。

除了代谢活动、各种生理生化物质含量变化之外，种子在老化过程中最明显的特征是氧自由基(如O2-、H2O2等)数量的逐渐增多，以及核酸降解等生化反应。SOD、POD是细胞中重要的抗氧化酶，在防御细胞结构被活性氧损伤方面发挥着重要作用，酶活性的变化预示着种子内部抗氧化系统抗氧化能力的变化。活性氧(ROS)对细胞结构具有非常强的破坏能力，较低浓度的ROS可以诱导某些抗氧化酶基因表达，从而提高抗氧化酶活性，将适量的活性氧消除。试验结果可以看出，在老化初期SOD、POD活性维持在较高水平，这与Jeng和 Sung等[26]的研究结果相类似，说明种子在贮藏初期会利用SOD、POD等抗氧化酶清除自由基，以保护细胞结构；但是随着老化程度的加剧，SOD、POD等抗氧化酶活性逐渐降低，以致产生过剩自由基[25]。POD、SOD作为细胞的保护酶，在受到人工老化处理时，这些保护酶清除活性氧和自由基的能力减弱，从而影响细胞的正常代谢。此次试验，在老化处理初期，保护酶的活性有明显下降的趋势，这会导致细胞内活性氧和自由基的增加，随着老化时间的延长，下降的趋势慢慢平缓，说明老芒麦自身也具有一定的抗老化作用。

3.2 人工老化对老芒麦种子醇溶蛋白组成的影响

醇溶蛋白作为种子储藏蛋白的一部分，在种子活力的维持方面发挥着重要作用。通过研究发现，与未老化的老芒麦种子醇溶蛋白图谱相比，经高温高湿老化后种子条带颜色开始变浅，有的条带甚至消失。结果同谭富娟等[36]研究结果一致，通过对燕麦种子贮存后遗传完整性研究发现，不同贮存年代种子的酯酶、淀粉酶、过氧化物酶等同工酶和醇溶蛋白图谱，陈旧种子中条带数明显减少、颜色变浅。蛋白质的种类以及含量变化是基因选择性表达的结果，种子老化程度的加剧可能抑制了某些基因型的表达或者导致了某些存活能力较差的基因型消失，最终导致谱带的丢失，这需要进一步从基因水平深入研究。

结合前人研究成果可以看出，种子老化是一个很复杂的生理生化代谢过程，活性氧(ROS)可能是加速种子老化的主要原因，试图从抗氧化酶活性角度出发，寻找调控抗氧化酶表达的相关基因，提高其表达水平，在一定程度上可能延缓种子的老化进程，这也对稀有种质以及濒危植物物种种质资源延续具有重要意义。

4 结论

(1)随着人工老化处理程度的加重，电导率、丙二醛、可溶性糖含量逐渐上升；可溶性蛋白含量以及POD和SOD活性均降低，因此，该指标可作为种子生活力的衡量指标。

(2)种子在老化过程中醇溶蛋白发生了一系列的变化，醇溶蛋白图谱颜色在处理第3 d时开始变浅，且随着老化时间的延长，α，β和ω区醇溶蛋白出现丢失的现象。