干旱胁迫对苜蓿幼苗叶绿素荧光特性和膜脂过氧化的影响

张翠梅,师尚礼,陈建纲

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续研究中心,甘肃 兰州 730070)

干旱是影响作物生长发育、分布和产量的主要非生物胁迫因素之一。据统计，世界上约有1/3 的地区属于干旱和半干旱区，我国干旱半干旱地区约占国土面积的1/2[1-2]。在我国黄土高原区普遍降水量少、蒸发量大，尤其黄土高原陇中地区旱灾十分频繁，对紫花苜蓿的种植面积和产量构成了严重威胁[3-4]。

干旱胁迫导致作物及牧草减产主要是通过影响其叶片的光合功能，抑制光合作用，进而导致减产[5]。大量研究发现，受到干旱胁迫后，多数植物的光合速率会下降[6-14]。现有的研究表明，在植物遭受轻度和中度干旱胁迫时，光合作用下降的主要原因是气孔限制，即气孔导度下降，导致胞间CO2浓度下降，进而降低光合速率；而在持续干旱或重度干旱胁迫时，因干旱致使叶绿素结构发生变化，植物膜系统受损伤，膜脂过氧化加剧而产生超氧自由基，光合色素严重降解，光合电子系统遭破坏，光系统Ⅱ(PSⅡ)活性下降，RuBP羧化酶活性受到抑制，从而导致光合作用受损，即所谓的光合作用的非气孔限制[15-16]。叶绿素荧光动力学技术是研究光合作用机制和探测光合生理状况的一种新兴技术，在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用。与反映“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数具有反映“内在性”的特点，是研究植物光合生理与逆境胁迫的内在探针[17-18]。通过探讨干旱对植物幼苗叶绿素荧光参数的影响，可有助于分析植物体内光合机构运行状况和鉴别植物的不同抵抗或忍耐干旱能力[19-21]。

干旱胁迫下，苜蓿体内光合生理指标的变化幅度及变化类型与其抗旱性密切相关，不同品种在抗旱性方面所表现的差异，都有其相应的生理生化基础[22]。已有的干旱胁迫对紫花苜蓿光合作用影响的研究多集中在对其光合特性及叶绿素荧光特性[6-8]、光合速率及叶绿素荧光参数日变化规律[23-24]等方面；而从苜蓿的水分状态、叶绿素含量、叶绿素荧光参数及膜脂过氧化作用等方面系统分析不同抗旱性苜蓿品种的光合生理适应机制的研究较少。研究不同抗旱性苜蓿品种响应干旱的光合生理机制，对发展节水农业具有重要意义。陇中苜蓿(Medicagosativacv.Longzhong)属地方品种，长期生长在年降水量200～350 mm的黄土高原陇中干旱地区，该地区每年连续5～6个月的旱灾经常性发生，连续8～9个月旱灾时而发生，陇中苜蓿对当地的生长条件表现出极强的适应性[25-26]；陇东苜蓿(Medicagosativacv.Longdong)亦属地方品种，生长于年均降水量400～600 mm的黄土高原陇东地区，抗旱性中等[27]；甘农3号紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)系育成的荒漠绿洲灌区丰产型品种，抗旱性较弱[24]。因此，通过PEG-6000 模拟干旱对不同抗旱性苜蓿品种幼苗的叶绿素荧光参数和膜脂过氧化程度影响的比较，明确干旱胁迫下不同抗旱性苜蓿品种的光合生理反应及适应机制差异，以期为紫花苜蓿品种的选育、推广和高产栽培提供光合生理生态方面的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以3个不同抗旱性紫花苜蓿品种，强抗旱陇中苜蓿、中抗旱陇东苜蓿和弱抗旱甘农3号紫花苜蓿为试验材料[28-29]。种子由甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室提供。

1.2 试验方法

2017年9月，在甘肃农业大学草业学院采用营养液砂培法培养幼苗。选择成熟、饱满且大小一致的苜蓿种子经0.1% HgCl2溶液消毒5 min后，用蒸馏水反复冲洗，再用滤纸吸干，均匀播种于培养钵中。选用消毒后的细砂(121℃，高温灭菌26 min)，装入直径为9 cm，高度为11 cm的营养钵中，摆放在长×宽×高为25 cm×15 cm×10 cm的塑料方盆中。播种后将种子转移至光照培养室中，每天光照14 h，光通量密度400 μmol/(m2·s)，昼夜温度分别为(25±1)℃和(20±1)℃，相对湿度60%。每天浇水保证其正常出芽，10 d后进行间苗，每钵保留10株长势一致的幼苗，并采用Hoagland营养液浇灌。幼苗生长至42 d时，每隔2 d每盆浇灌300 mL含PEG-6000(水势为-1.2 MPa)的Hoagland营养液进行胁迫处理，以仅含Hoagland营养液的处理为对照，连续培养12 d，分别在处理后0、3、6、9和12 d取样测定各项生理指标。每处理取3次重复。

1.3 指标测定

1.3.1 叶绿素荧光参数测定 于光照充足的上午9∶00～11∶00，采用德国WALZ 生产的便携式调制叶绿素荧光仪PAM-2100 对叶片进行活体测定。测定时，先将叶片置于暗中适应20 min，之后照射测量光<0.5 μmol/(m2·s)测定初始荧光(Fo)，然后照射饱和脉冲(2 800.0 μmol/(m2·s)测定最大荧光(Fm)。接着打开内源光化光(600.0 μmol/(m2·s))，持续5 min 后测定光适应下的稳定态荧光(Ft)，隔20 s 打开饱和脉冲(2 800.0 μmol/(m2·s))测定光适应下的最大荧光(Fm′)[30]。根据所测定的参数计算光系统Ⅱ(PSⅡ)潜在光化学效率(Fv/Fo)=(Fm-Fo)/Fo，PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm，PSⅡ光化学量子产量Yield=(Fm′-Ft)/Fm′，表观光合电子传递速率ETR=Y×PAR(光合有效辐射)×0.50×0.84，光化学猝灭系数qP=(Fm′-Ft)/(Fm′-Fo)，非光化学猝灭系数qN=(Fm-Fm′)/(Fm-Fo)。

1.3.2 生理指标测定 叶片相对含水量采用称重法测定[33]；叶绿素含量采用丙酮乙醇混合液提取法测定[32]；超氧阴离子自由基(O2·-)产生速率采用对氨基苯磺酸法测定[32]；双氧水(H2O2)含量采用KI 显色法测定[34]；羟自由基(OH·)浓度采用2-脱氧-D-核糖显色法测定[35]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[36]。

1.4 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0软件整理数据，SPSS 19.0 软件进行数据统计分析，用最小显著性差异法(LSD)进行差异显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对不同抗旱性苜蓿品种叶片相对含水量(RWC)和叶绿素(Chl)含量的影响

随胁迫时间延长，陇中苜蓿，陇东苜蓿和甘农3号苜缩幼苗叶片的RWC、Chla含量及Chla/b比值不断下降，Chlb含量不断增加(图1A，1B，1C和1D)。胁迫3 d时，供试苜蓿幼苗叶片的Chlb含量显著增加，Chla含量和Chla/b比值显著下降。胁迫6 d时，供试苜蓿叶片的RWC显著下降。胁迫第12 d时，陇中苜蓿，陇东苜蓿和甘农3号苜蓿幼苗叶片的RWC、Chla含量及Chla/b比值降至最低值，其中RWC的降幅分别为34.14%，44.64%和48.32%；而Chlb含量增至最高值，其增幅分别为100.29%，98.92%和91.93%(P<0.05)。

品种间比较，胁迫第9～12 d时，陇中苜蓿幼苗叶片的RWC均显著高于陇东苜蓿和甘农3号苜蓿(P<0.05)。胁迫第3～12 d时，陇中苜蓿幼苗叶片的Chla/b比值均显著高于陇东苜蓿和甘农3号苜蓿(P<0.05)。

2.2 干旱胁迫对不同抗旱性苜蓿品种叶片初始荧光(Fo)和最大荧光(Fm)的影响

随胁迫天数的增加，供试苜蓿的Fo值呈先增加后下降的变化趋势，而Fm值不断下降(图2A、2B)。陇中，陇东和甘农3号苜蓿的Fm值在胁迫第9 d时显著下降，且在胁迫12 d时降至最低值，降幅分别为14.26%，20.71%和29.31%(P<0.05)。除胁迫12 d外，供试苜蓿间的Fm值变化差异不显著(P>0.05)。

2.3 干旱胁迫对不同抗旱性苜蓿品种叶片潜在光化学效率(Fv/Fo)和最大光化学效率(Fv/Fm)的影响

供试苜蓿幼苗的Fv/Fo和Fv/Fm值随干旱时间的延长均呈不断下降趋势(图3A,3B)。胁迫9 d时，陇中苜蓿，陇东苜蓿和甘农3号的Fv/Fo和Fv/Fm值均开始显著下降，且在胁迫12 d时降至最低值，降幅分别为28.42%，29.77%，38.59%和9.83%，8.80%，10.79%(P<0.05)。品种间比较，陇中苜蓿的Fv/Fo值仅在胁迫第6 d时显著高于陇东苜蓿和甘农3号，而在其他胁迫时间下，三者的Fv/Fo和Fv/Fm值差异不显著。

图2 不同干旱胁迫时间处理下各抗旱性苜蓿品种叶片的Fo和Fm值Fig.2 Dynamics of initial fluorescence (Fo) and maximal fluorescence (Fm) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

图3 不同干旱胁迫时间处理下各抗旱性苜蓿品种叶片潜在Fv/Fo和Fv/Fm值Fig.3 Dynamics of potential photochemical efficiency (Fv/Fo) and the maximal chemical efficiency (Fv/Fm) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

2.4 干旱胁迫对不同抗旱性苜蓿品种叶片光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(qN)的影响

随胁迫时间的延长，供试苜蓿幼苗的qP不断下降；陇中苜蓿和陇东苜蓿的qN不断升高，而甘农3号的qN呈先升高后下降的变化趋势(图4A,4B)。胁迫第6 d，陇中苜蓿，陇东苜蓿和甘农3号的qP均显著下降，且在胁迫第12 d时降至最低值，降幅分别为39.39%，45.74%和65.05%(P<0.05)。供试苜蓿幼苗的qN均在胁迫6 d时显著增加，其中甘农3号的qN在胁迫第9 d时增至最大值，而陇中苜蓿和陇东苜蓿在胁迫第12 d时增至最大值，增幅分别为78.80%和82.26%(P<0.05)。品种间比较，甘农3号的qP和qN在胁迫9 d时显著高于陇中苜蓿和陇东苜蓿；而其qN在胁迫12 d时显著低于陇中苜蓿和陇东苜蓿(P<0.05)。

2.5 干旱胁迫对不同抗旱性苜蓿品种光系统Ⅱ实际光化学量子产量(Yield)及表观光合电子传递速率(ETR)的影响

供试苜蓿的Yield和ETR随胁迫时间延长呈不断下降的趋势(图5A，5B)。陇中苜蓿，陇东苜蓿和甘农3号的Yield和ETR均在胁迫第6 d时显著下降，且在胁迫第12 d时降至最低值，降幅分别为44.91%，56.65%，60.63%和36.50%，51.10%，52.89%(P<0.05)。胁迫第9 d时，陇中苜蓿的Yield和ETR均显著高于陇东苜蓿和甘农3号(P<0.05)；胁迫第12 d时，陇中苜蓿的ETR较陇东苜蓿和甘农3号分别高出31.77%和39.43%(P<0.05)。

图4 不同干旱胁迫时间处理下各抗旱性苜蓿品种叶片的qP和qN值Fig.4 Dynamics of photochemical quenching (qP) and non-photochemical quenching (qN) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

图5 不同干旱胁迫时间处理下各抗旱性苜蓿品种叶片的Yield和ETR值Fig.5 Dynamics of photochemical quantum yield of photosystem II (Yield) and photosynthetic electron transport rate (ETR) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

2.6 干旱胁迫对不同抗旱性苜蓿品种叶片活性氧(O2· -，H2O2和OH·)与丙二醛(MDA)含量的影响

随胁迫天数的增加，供试苜蓿幼苗O2·-产生速率，H2O2含量，OH·浓度和MDA含量均不断增加(图6A，6B，6C和6D)。胁迫3 d时，供试苜蓿的MDA含量均显著增加，陇中苜蓿和陇东苜蓿O2·-产生速率也显著增加。胁迫6 d 时，甘农3号的活性氧(H2O2，OH·和O2· -)含量显著增加；陇东苜蓿的H2O2含量和OH·浓度也显著增加，而陇中苜蓿幼苗的H2O2含量和OH·浓度自胁迫9 d时显著增加。胁迫第12 d，供试苜蓿幼苗的活性氧(H2O2，OH·和O2· -)和MDA含量均达到最高值。其中，陇中，陇东和甘农3号苜蓿叶片MDA含量的增幅为240.14%，352.61%和279.61%(P<0.05)。品种间比较，陇中苜蓿的H2O2和OH·含量在胁迫12 d时均最低，分别较陇东苜蓿和甘农3号低出12.36%、25.78%、17.39%和18.41%(P<0.05)。

2.7 不同抗旱性苜蓿品种各抗旱生理指标间关联性特征及主要成分分析

相关性分析表明，品种间比较，陇中苜蓿叶片内，RWC与Chla/b(r=0.901，P<0.01)正相关，与Chlb(r=-0.918，P<0.01)负相关，与MDA(r=-0.908，P<0.01)负相关；Fv/Fo与Fv/Fm(r=0.912，P<0.01)正相关，qP与Yield(r=0.936，P<0.01)正相关，qP与qN(r=-0.839，P<0.01)负相关；ETR与Yield(r=0.933，P<0.01)正相关；MDA与O2· -(r=0.928，P<0.01)、H2O2(r=0.969，P<0.01)和OH·(r=0.974，P<0.01)均呈正相关。陇东苜蓿叶片内，RWC与Chla/b(r=0.933，P<0.01)正相关，与Chlb(r=-0.928，P<0.01)负相关，与MDA(r=-0.938，P<0.01)负相关；Fv/Fo与Fv/Fm(r=0.980，P<0.01)正相关，qP与Yield(r=0.967，P<0.01)正相关，qP与qN(r=-0.915，P<0.01)负相关，ETR与Yield(r=0.952，P<0.01)正相关；MDA与O2· -(r=0.975，P<0.01)、H2O2(r=0.981，P<0.01)和OH·(r=0.973，P<0.01)均呈正相关。甘农3号叶片内，RWC与Chla/b(r=0.900，P<0.01)正相关，与Chlb(r=-0.833，P<0.01)负相关，与MDA(r=-0.777，P<0.01)负相关；Fv/Fo与Fv/Fm(r=0.966，P<0.01)正相关，qP与Yield(r=0.842，P<0.01)正相关，ETR与Yield(r=0.939，P<0.01)正相关；MDA与O2· -(r=0.993，P<0.01)、H2O2(r=0.984，P<0.01)和OH·(r=0.979，P<0.01)均呈正相关(表1，2和3)。

图6 不同干旱胁迫时间处理下各抗旱性苜蓿品种叶片活性氧(H2O2，OH·和O2· -)与MDA含量Fig.6 Dynamics ofreactive oxygen species(H2O2，OH·，and O2·-)and malondialdehyde (MDA) in leaf of different drought-tolerant alfalfa varieties under different drought stress time treatments

RWCChl a Chl b Chl a/bFo Fm Fv/FoFv/FmqPqNETRYieldO2·-H2O2OH·MDARWC1Chl a0.828∗∗1Chl b-0.918∗∗-0.869∗∗1Chl a/b0.901∗∗0.940∗∗-0.981∗∗1Fo-0.500∗∗-0.563∗∗0.627∗∗-0.637∗∗1Fm0.557∗∗0.395∗-0.640∗∗0.557∗∗-0.432∗1Fv/Fo0.695∗∗0.639∗∗-0.803∗∗0.765∗∗-0.819∗∗0.855∗∗1Fv/Fm0.848∗∗0.801∗∗-0.892∗∗0.885∗∗-0.728∗∗0.726∗∗0.912∗∗1qP0.795∗∗0.908∗∗-0.872∗∗0.922∗∗-0.560∗∗0.415∗0.640∗∗0.777∗∗1续表1RWCChl a Chl b Chl a/bFo Fm Fv/FoFv/FmqPqNETRYieldO2·-H2O2OH·MDAqN-0.604∗∗-0.805∗∗0.716∗∗-0.804∗∗0.507∗∗-0.180-0.443∗-0.585∗∗-0.839∗∗1ETR0.878∗∗0.962∗∗-0.922∗∗0.961∗∗-0.582∗∗0.488∗∗0.698∗∗0.833∗∗0.918∗∗-0.793∗∗1Yield0.768∗∗0.948∗∗-0.852∗∗0.928∗∗-0.540∗∗0.373∗0.608∗∗0.769∗∗0.936∗∗-0.878∗∗0.933∗∗1O2·--0.823∗∗-0.686∗∗0.886∗∗-0.828∗∗0.488∗∗-0.586∗∗-0.673∗∗-0.716∗∗-0.705∗∗0.586∗∗-0.807∗∗-0.659∗∗1H2O2-0.876∗∗-0.685∗∗0.930∗∗-0.852∗∗0.516∗∗-0.666∗∗-0.741∗∗-0.790∗∗-0.701∗∗0.510∗∗-0.796∗∗-0.641∗∗0.959∗∗1OH·-0.907∗∗-0.778∗∗0.956∗∗-0.913∗∗0.524∗∗-0.612∗∗-0.723∗∗-0.818∗∗-0.763∗∗0.655∗∗-0.854∗∗-0.740∗∗0.930∗∗0.961∗∗1MDA-0.908∗∗-0.792∗∗0.981∗∗-0.936∗∗0.551∗∗-0.650∗∗-0.759∗∗-0.835∗∗-0.804∗∗0.641∗∗-0.871∗∗-0.764∗∗0.928∗∗0.969∗∗0.974∗∗1

注：*、**分别表示在5%和1%水平显著性，下同

表2 干旱胁迫下陇东苜蓿各项耐旱性状相关系数矩阵

表3 干旱胁迫下甘农3号各项耐旱性状相关系数矩阵

主成分分析表明，干旱胁迫下，决定陇中苜蓿抗旱性第1主成分大小的主要是qN、Yield、Chla、qP、ETR，第2主成分大小的主要是Fm，两个主成分均与叶绿素荧光特性相关的性状。决定陇东苜蓿抗旱性第1主成分大小的主要是Chlb、OH·、MDA、Chla/b、H2O2，可以概括为叶绿素及膜脂过氧化因子；决定甘农3号苜蓿抗旱性第1主成分大小的主要是H2O2、O2· -、MDA、Fm、OH·，可概括为膜脂过氧化因子；此外，决定陇东苜蓿和甘农3号苜蓿第2主成分大小的都是Fo(表4)。

表4 干旱胁迫下各抗旱性苜蓿品种主成分特征向量及贡献率

3 讨论

植物吸收光能后主要有热耗散、光合作用和荧光3个去向。其中，绝大部分光能以热耗散的形式释放，而用于进行光合作用的光能不足吸收光能的20%，还有一部分光能以叶绿素荧光方式释放，三者之间此消彼长[18]。光合作用是植物生长的基础，是植物生产力构成的最主要因素。干旱胁迫会抑制光合作用光反应中心电子传递、光能转换、光合磷酸化及光合作用暗反应等一系列过程[37-38]。叶绿素荧光参数(如Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、Yield、ETR、qP和qN)可以更好地从内部快速灵敏、无损伤地反映PSⅡ的状态，成为分析评价植物光合机构的功能以及环境胁迫对其影响的重要参数[20-21,39-40]。叶绿素荧光淬灭系数有qP和qN两种，其中qP反映的是PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额，而qN反映的是PSⅡ天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分[17]。通过对不同抗旱性苜蓿品种幼苗叶片的叶绿素荧光参数分析，结果发现，干旱胁迫下，供试苜蓿幼苗的qN显著增加，而Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、qP、Yield和ETR显著降低，说明干旱胁迫破坏了供试苜蓿的PSⅡ反应中心，抑制了PSⅡ光化学活性，降低了PSⅡ原初光能转化效率，使PSⅡ潜在活性受损，进而破坏了紫花苜蓿的光合作用原初反应过程。这与前人对干旱胁迫下，番茄(Lycopersiconesculentum)[1]、甜菜(Betavulgaris)[9]、花生(Arachishypogaea)[10]、玉米(Zeamays)[39]和小麦(Triticumaestivum)[4,10]等叶绿素荧光参数变化的研究结果一致。

供试苜蓿幼苗叶片的叶绿素荧光参数变化对干旱胁迫表现相同和差异的响应特征。苜蓿的qP、Yield和ETR均在胁迫第6 d时显著下降，而Fm、Fv/Fo和Fv/Fm则均在胁迫第9 d时显著降低，说明超过一定胁迫时间的水分亏缺会引发苜蓿植株光合机构的异常，同时影响光合电子的传递，进而降低了紫花苜蓿的光合作用。相比之下，干旱胁迫下，叶绿素荧光参数(Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、qP、Yield和ETR)的降幅以强抗旱陇中苜蓿最低，弱抗旱甘农3号最高，且在胁迫第12 d时，陇中苜蓿的qP和ETR均显著高于陇东苜蓿和甘农3号。干旱胁迫第3～12 d时，供试苜蓿的qN均显著增加，但胁迫时间超过9 d时，甘农3号qN的增幅降低。说明供试苜蓿均能以热耗散的形式散失叶片吸收的热能，以防御光抑制带来的破坏，从而保护PSⅡ免受伤害，但甘农3号的热耗散能力在胁迫超过9 d时显著下降。陇中苜蓿的光合结构受破坏的程度低于陇东苜蓿和甘农3号，从而表现出较强的非辐射热耗散能力和较高的电子传递速率。这与李超等[24]、谢燕等[41]和张仁和等[42]的研究结果一致，但与韩瑞宏等[6]的研究结果不同，可能是由于干旱胁迫下，除PSⅡ反应中心电子传递活性外，其他因素也会引起苜蓿光合机构的损伤。因此，试验加入叶片RWC、叶绿素含量及活性氧产生速率等指标以系统分析不同抗旱性苜蓿品种响应干旱胁迫的光合生理差异[15-16]。

干旱胁迫下，植物的PSⅡ活性降低导致激发能的上升，引起能量过剩，产生过量的活性氧(ROS)，若不及时清除ROS会造成氧化胁迫[12,43]。研究表明，随胁迫时间的增加，供试苜蓿的RWC不断下降，而活性氧(O2· -，H2O2和OH·)和MDA含量均持续增加，说明持续干旱胁迫会引起苜蓿细胞脱水，破坏苜蓿体内ROS的产生与清除平衡状态，细胞内ROS的大量积累加剧了膜脂过氧化作用，导致光合器官结构与功能的破坏及细胞内物质和能量代谢的失调，最终降低了叶片光合能力[44]。叶绿素含量、叶绿素成分组成及比例在不同植物间有着不同的变化[2,12]。Guo等[12]研究发现，干旱胁迫下，黑果枸杞(Lyciumruthenicum)的Chla，Chlb和Chl(a+b)的含量降低且Chla/b比率增加。而此次研究发现，随胁迫时间延长，供试苜蓿的Chla含量和Chla/b比值不断下降，而Chlb含量却持续增加，可能是由于干旱胁迫下，Chla对ROS的反应较Chlb敏感，Chla含量的大幅降低引起了Chla/b比值的下降[45]。胁迫第3～9 d时，陇中苜蓿的RWC和Chla/b比值显著高于陇东苜蓿和甘农3号，而H2O2含量和OH·浓度显著低于陇东苜蓿和甘农3号，说明一定干旱胁迫条件下，陇中苜蓿具有较高的RWC和Chla/b比值，叶片遭受ROS的氧化损伤程度较轻，从而表现出较强的抗旱性；而当胁迫时间超过9 d时，供试苜蓿的MDA含量变化差异不显著，说明干旱胁迫对供试苜蓿的膜系统均会造成严重的氧化损伤，供试苜蓿抗旱能力的差异可能与其体内酶促及非酶促抗氧化系统的协调能力有关。

通过相关性分析所测指标间的相关密切程度及其与苜蓿抗旱能力的关系，结果发现，除Fo外，其他指标间的相关密切程度均较高，说明干旱胁迫下，供试苜蓿叶绿素荧光参数变化及其体内膜脂过氧化程度能够同时反映供试苜蓿的抗旱能力强弱。采用主成分分析进一步鉴定出对供试苜蓿抗旱能力贡献较大的指标，其中对陇中苜蓿抗旱能力影响最大的主要为叶绿素荧光特性因子，而对陇东苜蓿和甘农3号抗旱能力影响最大的指标主要为膜脂过氧化因子。说明随胁迫时间延长，不同抗旱性苜蓿品种体内的生理指标响应干旱胁迫的敏感性不同。干旱胁迫对陇中苜蓿的叶绿素荧光参数影响较小，但却显著增加了陇东苜蓿和甘农3号叶片内OH·，H2O2、O2· -和MDA含量，这可能也是陇中苜蓿具有强抗旱性的重要生理原因。然而，试验仅从叶绿素荧光特性和膜脂过氧化程度的变化角度研究了不同抗旱性苜蓿品种响应干旱胁迫的生理机制。有关干旱胁迫下不同抗旱性苜蓿品种叶片PSⅡ光能利用与活性氧代谢协同调控的分子机制还需进一步深入研究。

4 结论

随干旱胁迫时间延长，陇中苜蓿、陇东苜蓿和甘农3号幼苗的RWC、Chla含量、Chla/b比值、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、qP、Yield和ETR不断下降；而Chlb含量、ROS(O2· -，H2O2和OH·)和MDA含量不断增加。但陇中苜蓿叶片RWC、Chla含量、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、Yield和ETR的降幅及H2O2和MDA含量的增幅均低于陇东苜蓿和甘农3号。供试苜蓿叶片的RWC、Chla、Chla/b、Fm与Fv/Fo、Fv/Fm、ETR、Yield均呈极显著正相关，RWC、Chla、Chla/b、Fm、Fv/Fm、qP、ETR、Yield与O2· -、H2O2、OH·、MDA均呈极显著负相关。其中，对陇中苜蓿抗旱性影响最大的主要为叶绿素荧光特性因子，而对陇东苜蓿和甘农3号抗旱性影响最大的主要为膜脂过氧化因子。相比陇东苜蓿和甘农3号，陇中苜蓿的各项叶绿素参数受干旱影响小，其抗旱的重要生理原因是具有较强的叶片保水能力，较低的光合机构损伤及膜脂过氧化程度。