温度及培养基对黄花棘豆种子萌发及幼苗生长的影响

王玉琴，尹亚丽，鲍根生，宋梅玲，王宏生

(1.省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016； 2.青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室，青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016)

黄花棘豆(Oxytropisochrocephala)是豆科(Leguminosae)棘豆属(Oxytropis)多年生草本植物，该植物全草有毒，广泛分布于甘肃、青海、宁夏、西藏等地区[1]，其根系发达，籽多，生命力强，常呈片状集中分布，并不断的滋生蔓延，并与优良牧草争夺生境，使得优良牧草比例下降，草地生态遭到严重破坏。苦马豆素(swainsonine，SW)是黄花棘豆的主要有毒成分，动物长期或过量采食可损害中枢神经系统，影响牲畜繁殖能力和畜种改良，并致使牲畜运动和自控功能降低以致引起肌肉麻痹，乃至窒息死亡[2-4]，极大地降低了草地的利用率，给整个黄花棘豆危害区的畜牧业造成了巨大的经济损失。目前，通过人工挖除、火烧、应用除草剂以及生物防治等方法来控制黄花棘豆对放牧动物的危害[5]，但由于缺乏对黄花棘豆的繁殖扩散机理和动物中毒机理的深入了解，因而仍不能从根本上控制棘豆的危害。

研究报道黄花棘豆除了含有有毒成分苦马豆素外，还具有丰富营养价值。王凯[6]报道青海3种棘豆均含有较高的蛋白质，其中黄花棘豆的蛋白质含量接近于上等苜蓿。沈明华等[7-9]的研究表明黄花棘豆的粗蛋白含量接近或超过上等苜蓿干草，且具有较高的粗脂肪、总磷含量显著高于青海；研究还表明7，8和9月采集的黄花棘豆所含蛋白质均较高，其蛋白质含量超过或接近苜蓿干草，且7月的蛋白质含量最高，9月的粗脂肪含量最高，黄花棘豆是一种潜在的高蛋白质优质牧草资源。因此，人们一直寻找有效措施对黄花棘豆进行脱毒处理，从而最大限度的利用黄花棘豆。Oldrup等[10]和周启武等[11]研究发现在疯草种子的糊粉层及内皮薄壁层分布着内生真菌，而种子胚体中没有内生真菌的分布。Creamer R等[12]研究发现疯草内生真菌分布在剥离下来的种皮或薄壁组织层中，而在剥离种皮的种子中没有分布，且He等[13]将小花棘豆种子去皮后进行组织培养，获得了无毒小花棘豆植株。因此，结合前人的研究结果，为了进一步研究黄花棘豆的脱毒技术，对黄花棘豆种子进行剥皮处理，通过研究不同温度及培养基对黄花棘豆种子发芽率及幼苗生长的影响，筛选最适合黄花棘豆离体种子萌发及种苗生长的条件，为黄花棘豆的开发利用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

试验所用黄花棘豆种子于2015年、2016年9月采自青海省湟源县，该县地理位置N 36°25′42.1″，E 101°14′02.3″，海拔3 358 m，采后自然阴干，随机挑选籽粒饱满的种子4℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 种子带菌率的检测 将种子在5% NaOH中浸泡过夜，用蒸馏水缓慢冲洗1 min，加入20～30 mL乳油-苯胺蓝溶液染色，在水浴中沸煮3～5 min，以保证其充分染色，再用自来水冲洗3次，然后取1粒种子放在载玻片上，用拨针挑取种皮，加1～2滴染色液，盖上盖玻片在电镜下检测并统计种皮和糊粉层中内生真菌的带菌率[14]。

1.2.2 种子预处理 将黄花棘豆种子先用98%浓硫酸溶液浸泡10 min，无菌水清洗3～5次，70%酒精消毒30 s，再用5.4%次氯酸钠溶液消毒20 min，最后用无菌水清洗3～5次。将消毒的种子进行剥皮，在无菌水中浸泡24 h后，进行种子发芽试验[13]。

1.2.3 不同温度对黄花棘豆种子发芽及幼苗的影响 将预处理好的种子置于MS平板培养基上，分别放入10、15、20、25、30、35和40℃等7个温度梯度的人工气候箱中，进行种子发芽试验，每个温度下设10个重复，每个重复10粒种子，培养5 d后统计种子发芽率，种子发芽以胚根长等于种子长一半或芽长等于种子长即为发芽，并于试验的15 d后用直尺测定幼苗的长度、根长以及两子叶间宽度。

种子发芽率(%)=发芽种子数/总种子数×100%

1.2.4 不同培养基对黄花棘豆种子萌发及幼苗的影响 选用MS、SH、N6、White、LS、MT、B5等7种培养基[15]，将预处理的种子分别置于培养基上，放入相对湿度为85%，16 h光照/8 h黑暗，温度为25℃的人工气候箱中，进行种子发芽及幼苗生长最佳培养基的筛选。每个培养基下设10个重复，每个重复10粒种子，培养5 d后统计种子发芽率，15 d后用直尺测量幼苗的长度、根长以及两子叶间宽度。

1.3 数据统计与处理

所有数据釆用Excel软件进行数据整理，运用SPSS 22.0分析软件对所测数据进行各指标的显著性差异分析，同时通过对各培养基的因子分析确定主成分，并计算各主成分得分，再利用综合得分公式求出各培养基综合分值，进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 种子带菌率的检测

通过检测黄花棘豆种子中种带内生真菌情况，发现黄花棘豆种皮带菌率达98%，种胚带菌率为0(见图1)。

2.2 不同温度对黄花棘豆种子萌发及幼苗的生长影响

随着培养温度的变化，黄花棘豆种子发芽率变化明显，培养温度为25℃时，黄花棘豆种子发芽率最高(94.72%)。培养温度在10～25℃时，随着温度的升高，种子发芽率也逐渐升高，当培养温度继续升高时，种子发芽率呈下降趋势。方差分析显示，黄花棘豆种子在培养温度为10℃时，种子发芽率显著低于其他温度(P<0.05)，15～40℃种子发芽率差异不显著，但总体呈先上升后下降趋势(表1)。

表1 温度处理下黄花棘豆种子的发芽率

通过测定黄花棘豆幼苗的长度、根长以及两子叶间宽度得到幼苗茎叶长、根长以及两子叶间宽度在10～40℃时变化均呈先上升后下降趋势，当培养温度为30℃时，幼苗茎叶长、根长以及两子叶间宽度均达到最大值，且茎叶长显著高于其他温度处理(P<0.05)，其次为25℃，幼苗根长和两子叶间宽度在20～30℃时差异不显著。结合图3分析，黄花棘豆种子在25～30℃生长明显，35℃之后种子出现畸形，因此，种子萌发的最适温度在25～30℃。

2.3 不同培养基对黄花棘豆种子萌发及幼苗的影响

7种培养基对黄花棘豆种子发芽率的影响有差异，其中，发芽率最高的是N6培养基，显著高于SH、White，LS和B5培养基(P<0.05)，其次为MS、MT，但这3种培养基差异不显著。通过测定黄花棘豆幼苗的长度、根长以及两子叶间宽度(图5)得到，两子叶宽度最大的是LS培养基，显著高于其他培养基(P<0.05)；幼苗长度最长的是White培养基，其次为SH和N6；幼苗根长最佳培养基为MT，其次为White，LS和SH培养基，根长最短的是B5培养基。根据不同培养基对种子发芽率、两子叶宽、茎叶长以及根长的影响，通过主成分分析可得，黄花棘豆种子萌发及幼苗生长最佳培养基为MT培养基(表2)。通过图6观察可知，幼苗在各种培养基上的生长状况也不相同，在B5上生长最差，并出现畸形。在MT，White和N6培养基上幼苗根生长良好，但地上部分生长明显较弱，MS，SH和LS培养基上幼苗生长良好。

图1 黄花棘豆种皮及糊粉层带菌状况Fig.1 Seed coat and aleurone layer with endophytic fungi of Oxytropis ochrocephala

图2 不同温度处理下黄花棘豆幼苗长度、根长及两子叶间宽Fig.2 Effects of temperature on length，root length and width between two cotyledons of seedling

图3 不同温度处理下黄花棘豆幼苗的生长情况Fig.3 Effects of temperature on the seedling

图4 不同培养基处理下黄花棘豆种子的发芽率Fig.4 Effect of different media on seed germination rate of Oxytropis ochrocephala

图5 不同培养基处理下黄花棘豆幼苗长度、根长及两子叶间宽Fig.5 Effects of different media on length，root length and width between two cotyledons of seedling

图6 不同培养基处理下的黄花棘豆幼苗Fig.6 Effects of different media on seedling

序号培养基F1F2F排序1SH-0.107-0.799-0.34452N60.9020.5760.79023White-0.205-1.955-0.80564LS0.9010.3540.71435MT1.4500.3981.08916B5-2.8130.641-1.62977MS-0.1280.7860.1864

3 讨论

近年来，国内外对于黄花棘豆的研究主要集中在黄花棘豆的中毒调查[16]、对放牧家畜的危害[17-18]、有毒成分的研究[19-20]及营养成分分析等方面[6]，对于黄花棘豆种子的研究，也主要集中在种子化学成分分析[21]、种子休眠破除方法以及光照、恒温及变温对种子发芽率的影响[22-25]，但对黄花棘豆的开发利用研究相对较少。由于黄花棘豆种皮的内皮层及糊粉层分布着内生真菌，经检测其带菌率为98%，但种胚内的带菌率为0，所以通过物理方法将黄花棘豆种皮剥除，用黄花棘豆种胚进行试验，目的是获得无毒的黄花棘豆幼苗，并设置不同温度及不同培养基进行黄花棘豆组织培养过程中种子萌发阶段的最佳条件筛选，试验结果表明黄花棘豆种子萌发的最佳温度为25℃，幼苗生长的较适温度为25～30℃，这与陈超等[25]、赵清梅等[26]研究在温度为25℃时黄花棘豆种子发芽率最高的结果一致，说明不论直接用培养皿里放入灭菌滤纸还是用组织培养的方式对黄花棘豆种子进行发芽试验，黄花棘豆的种子发芽的最适温度均为25℃。但该结果与陆家芬等[23]的研究结果15～20℃为黄花棘豆的适宜发芽温度，且温度为25℃时，种子霉变率较高不同，这可能是由于消毒不彻底，种子发芽前处理不同以及采取的发芽方式不同导致。

试验结果表明，7种培养基对黄花棘豆种子发芽率的影响差异明显，其中发芽率最高的是N6培养基，显著高于SH，White，LS和B5培养基(P<0.05)，其次为MS、MT，通过测定黄花棘豆幼苗的长度、根长得到，幼苗长度最长的是White培养基，其次为SH和N6；幼苗根长最佳培养基为MT，其次为White，LS和SH培养基，根长最短的是B5培养基，试验经过主成分分析得到黄花棘豆种子萌发及幼苗生长最佳培养基为MT培养基。自1937年White建立第一个植物组织培养基以来，许多研究者报道了各种培养基，其数量多，配方各异，目前常用的植物组织培养基有MS、White、B5、N6、Nitsh、Miller、SH、LS等，其中White培养基主要用于生根培养；N6主要为水稻等禾谷类作物花药培养设计；B5主要特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫铵素，适合于某些双子叶植物特别是木本植物的生长；SH在不少单子叶和双子叶植物上使用，效果很好；MS是目前最为广泛的一种培养基，能够满足组织对营养元素的需求，有加速养物生长的作用[15]。在试验中虽然经过主成分分析得到黄花棘豆种子萌发及幼苗生长最佳培养基为MT培养基，但经过对比培养基配方，MT除了有机物部分比MS含量增加，其他成分均相同，再结合幼苗生长情况，MT培养基上的幼苗地上部分比MS培养基生长弱。另外，虽然N6培养基的种子发芽率最高，但是N6上幼苗生长较弱，因此，为了给黄花棘豆无毒株系提供优良的组织培养种苗，最终将黄花棘豆的最佳组织培养培养基确定为MS培养基。

4 结论

通过比较不同培养温度及不同培养基下黄花棘豆种子发芽及幼苗生长状况，随着培养温度的变化，黄花棘豆种子发芽率变化明显，25℃下种子发芽率最高，为94.72%，当培养温度为30℃时，幼苗茎叶长、根长以及两子叶间宽度均达到最大值，且在10～40℃种子发芽率、幼苗茎叶长、根长及两子叶间宽度均呈先上升后下降趋势。7种培养基中发芽率最高的是N6培养基，通过主成分分析得到黄花棘豆种子萌发及幼苗生长最佳培养基为MT培养基，但经过对比培养基配方，将最终培养基确定为MS培养基。