顶花板凳果耐寒性分析及评价指标的筛选

张 雨，贾民隆，曹冬梅，王云山，邢国明

（1.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；2.山西省农业科学院园艺研究所，山西太原030031）

顶花板凳果（Pachysandra terminalis Sieb.et Zucc）为黄杨科（Buxaceae）板凳果属（Pachysandra Michx.）多年生常绿草本，又称富贵草、顶蕊三角咪，原产于我国湖北、四川、陕西和甘肃等省区，在日本也有分布[1]。其株高20～30 cm，茎肉质，有分枝，无毛；叶互生，革质，有光泽；穗状花序顶生，单性同株，花期4—5月；果卵形，果期9—10月。顶花板凳果性喜阴湿的环境，多生于海拔1 350～2 200 m的山谷沟边或林中阴湿处，耐寒性强，引种到北京的2年生苗不需防寒措施可露地越冬[2-4]。其株型美观、四季常绿，是一种极具观赏价值的园林植物。顶花板凳果还有很高的药用价值[5]。目前，国内外对板凳果的研究报道较少，且大多集中在化学成分和药用与临床方面。

本研究以顶花板凳果为材料，分析其在冬季自然低温胁迫下各生理指标的变化，并通过主成分分析法评价各个测定指标的贡献率，筛选板凳果抗寒性的重要指标，以期为板凳果抗寒性和耐寒机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为顶花板凳果，苗龄2 a，在室温22～25℃下进行常规盆栽管理，选取大小一致、长势健壮的植株进行低温处理。

1.2 试验处理

2018年2月在山西省农业科学院园艺研究所将选取的植株放出室外进行自然低温处理，连续胁迫96 h，每日温度为2～15℃。分别在处理0，48，96 h后取成熟叶片用于各项生理指标的测定。以处理0 h作为对照。每处理3次重复。

1.3 测定项目及方法

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[6]测定；SOD活性采用氮蓝四唑法[6]测定；叶绿素含量采用丙酮、乙醇、水混合液浸提法[7]测定；相对电导率采用电导仪法[8]测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法[9]测定；Ca2+浓度采用电感耦合等离子质谱（ICP-MS）进行测定。

1.4 数据分析

使用Excel 2007进行数据整理，用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析法和Duncan法进行多重比较及差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 低温处理对板凳果叶片的影响

随着低温处理的持续，板凳果叶片受冻症状逐渐加重。在低温处理48 h时，叶片卷曲，背面出现水渍状，正面呈深绿色；在低温处理96 h时，叶片更加卷曲，变软变薄，背面水渍状情况严重，叶色与处理48 h相比差异不大。

2.2 低温处理对板凳果叶片相对电导率和丙二醛含量的影响

从图1可以看出，板凳果在低温处理后，电导率呈上升趋势。在低温处理48 h时，电导率比对照高37.72百分占，且显著高于对照；在低温处理96 h时，电导率高达86.99%，显著高于对照。本试验结果与前人[10-11]研究结果一致，说明随着低温胁迫的持续，板凳果细胞膜受到了损伤，导致电解质渗透率升高。

由图2可知，板凳果在低温处理后，MDA含量呈现上升趋势。在处理48 h时，MDA含量比对照高0.023 mmol/g，但与对照差异不显著；在处理96 h后达到最高，为0.343 mmol/g，是对照的1.6倍，与对照差异显著。

2.3 低温处理对板凳果叶片SOD活性的影响

由图3可知，在低温处理后板凳果的SOD活性呈上升趋势。在低温处理48 h时，SOD活性与对照相比无明显变化。在低温处理96 h时，SOD活性显著上升，是对照的1.327倍，与对照差异显著。SOD活性升高是植株的保护性应激反应，本研究结果与张军等[12]的研究结果相似。

2.4 低温处理对板凳果叶片可溶性蛋白含量的影响

由图4可知，板凳果在低温处理后，可溶性蛋白含量呈上升的趋势。在低温胁迫48 h时，可溶性蛋白比对照高6.812 mg/g，但差异不显著；在处理96 h时，可溶性蛋白含量比对照高9.929 mg/g，差异显著。这与李钊[13]的研究结果相似。

2.5 低温处理对板凳果叶片叶绿素含量的影响

从图5可以看出，板凳果在低温处理后，叶绿素各含量变化趋势相似，在处理48 h时，类胡萝卜素（Car）含量、叶绿素 a（Chl.a）含量、叶绿素 b（Chl.b）含量和叶绿素（Chl.a＋b）总量均升高，分别是对照的1.307倍、1.401倍、1.566倍、1.443倍，均与对照差异显著；在处理96 h时，叶绿素各含量与48 h相比变化不大，差异不显著。

2.6 低温处理对板凳果叶片钙离子浓度的影响

从图6可以看出，板凳果在低温处理48 h后，钙离子浓度比对照高38.25%，且显著高于对照；在处理96 h后，钙离子浓度比48 h下降了15.10%，差异显著；处理48 h和处理96 h的钙离子浓度均显著高于对照。

2.7 板凳果抗寒性与叶片生理指标间相关性分析

利用SPSS软件对板凳果叶片MDA含量、相对电导率、可溶性蛋白含量、SOD活性、类胡萝卜素含量、叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总量和钙离子浓度进行了相关性分析。由表1可知，板凳果的9个生理指标间存在着一定的相关性，可溶性蛋白含量和相对电导率显著正相关；SOD活性和MDA含量之间显著正相关；叶绿素a含量和类胡萝卜素含量之间极显著正相关；叶绿素总量与类胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b含量均呈显著正相关。

表1 各抗寒指标相关性分析

2.8 主成分分析

利用SPSS软件对板凳果叶片MDA含量、相对电导率、可溶性蛋白含量、SOD活性、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量和钙离子浓度这9个指标进行主成分分析。从表2可以看出，主成分1的贡献率为78.953%，基本把板凳果抗寒性的信息反映出来。其中，类胡萝卜素含量、可溶性蛋白含量、叶绿素a含量、叶绿素总量、相对电导率和叶绿素b含量的系数分别为0.991，0.985，0.983，0.967，0.956 和 0.907，为较大特征向量，与板凳果抗寒性关系密切，这与相关性分析结果一致。

表2 主成分分析

3 结论与讨论

相对电导率的大小直接反映了细胞膜结构和功能的受损程度。在低温胁迫条件下，细胞膜透性增大，胞内电解质外渗，相对电导率增加[14]，植物的抗寒性和电导率呈负相关[15]。本试验结果表明，随着低温的持续，板凳果的电导率呈上升趋势，这与前人[16-17]研究结果一致，说明在低温处理下，板凳果的细胞膜受到了损伤，导致电解质不断渗出。

大量的研究结果表明，温度越低或低温处理时间越长，植物体内MDA的含量则会越多，细胞膜受到的损伤就越大。超氧化物歧化酶（SOD）是植物体保护酶系统中重要的保护酶，对保持细胞内活性氧产生与清除之间的平衡、维持细胞的完整与稳定有重要作用，并能提高植物对逆境的适应能力[18]。板凳果在低温处理后，MDA含量不断上升。在低温处理48 h时，增加幅度较小，在低温处理96 h时，MDA含量才有了较明显的增加，这与SOD活性变化一致，说明低温处理初期板凳果细胞膜受到的伤害较小，积累的有害物质较少，SOD活性上升幅度不大，而到了低温处理后期，膜脂过氧化程度加重，MDA含量显著升高，产生了大量的有害物质，SOD活性大幅度升高以清除体内产生的有害物质，从而减轻低温对植物的伤害。

可溶性蛋白是重要的渗透调节物质，可增加细胞保水力，使植物体抗寒性提高。多数研究认为，低温胁迫下，植物可溶性蛋白质含量增加[19]。本试验结果表明，板凳果在低温处理后，可溶性蛋白含量呈上升趋势，这与严海燕[20]对富贵草抗寒性的研究结果一致，说明在低温逆境下，板凳果通过增加可溶性蛋白质的含量来增加细胞保水力，从而在一定程度上提高其抗寒性。

叶绿素含量常作为反映低温对植物伤害程度的生理指标之一。一般情况，低温下叶绿素含量较高的植物，有利于光合作用进行，有机物积累增加，对抗寒有利[21]。本研究结果表明，随着低温的持续，板凳果叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量升高，这与杜春芳[22]对甘蓝型油菜抗寒性研究结果一致，说明板凳果可以通过叶绿素含量的增加，促进光合作用，提高其抗寒性。类胡萝卜素含量在整个处理过程中变化较稳定，这与郭爱华等[23]的研究结果一致，主要因为类胡萝卜素可参与植物光合机构中过剩光能的耗散，使植物免受光抑制的损伤。

Ca2+作为耦联胞外信号与细胞内生理生化反应的第二信使，调控多种酶活性，在植物的生长发育及植物对环境的反应与适应中有着极其重要的作用[24-25]。当细胞受到低温环境的刺激时，胞质内Ca2+浓度水平迅速升高，高浓度的Ca2+直接或间接（通过钙调素CaM）活化靶酶，从而产生相应的生理生化反应来抵御低温[26]。刘雪琴[27]在探究低温下三尖杉钙浓度的变化时发现，低温锻炼可以使钙离子浓度迅速上升，之后又恢复到静息状态。本试验中，在低温处理48 h时，钙离子浓度升高，在处理96 h时，与处理48 h相比有所下降，但仍显著高于对照，说明低温处理会使钙离子浓度升高，从而直接或间接地提高植株的抗寒性。

综上所述，板凳果在自然低温处理过程中，随着低温胁迫的持续，可溶性蛋白含量、叶绿素含量以及SOD活性不断升高，说明板凳果可通过自我调节来适应低温环境，从而减轻低温造成的伤害；相对电导率、MDA含量和钙离子浓度也呈上升趋势，说明板凳果对低温的调节能力是在一定范围内的。植物的抗寒性是一个复杂的生理过程，不能仅从单项指标来评价其抗寒性。本试验通过主成分分析和相关性分析得出，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素含量、类胡萝卜素含量、可溶性蛋白含量和相对电导率这6个指标与板凳果抗寒性密切。