蛋白质组学技术研究凡纳滨对虾冰藏期间肌肉蛋白的变化

郑鸯鸯 ，吉 薇 ，吉宏武 *，2，3，4，苏伟明 ，2，3，刘书成 ，2，3，4

（1.广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江 524088；2.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江524088；3.广东省海洋食品工程技术研究中心，广东 湛江524088；4.水产品深加工广东省普通高校重点实验室，广东 湛江 524088）

凡纳滨对虾 （Litopenaeus vannamei）属于对虾科、滨对虾属[1]，是中国主要的对虾品种，也是我国出口对虾的主要品种[2]，深受消费者的欢迎。但是凡纳滨对虾水分含量高，内源酶种类丰富，运输销售过程中极易出现肌肉自溶、组织软化等问题，致使品质下降、贮藏时间缩短而影响其商业价值。文献报道指出，内源酶和微生物作用引起的肌原纤维蛋白等细胞骨架成分的蛋白质降解是水产品肌肉软化、腐败变质的主要原因[3-6]。

澳大利亚学者Wilkins和Williams早在1994年最先提出了“蛋白质组”这个概念[7]，定义为一个基因组表达的所有蛋白质。蛋白质组研究的是不同时间和空间上发挥功能的特定蛋白质群体，目的是要从蛋白质水平上探索蛋白质的作用方式、调控机制、功能机理以及蛋白质群体内的相互作用[8]。蛋白质组数据库是生物信息学的重要信息来源，通过这些已建数据库展开蛋白质的生物信息学分析能够提供各种生理机制过程中参与决定肌肉品质的蛋白质结构和功能等方面的信息[9]。近年来，蛋白组学已被广泛应用到水产品的研究中。早期蛋白组学对水产品的研究主要集中在分类学上，随后蛋白组学又逐步成为了解免疫应答机制的的一种手段，如Jiang H等[10]利用比较蛋白组学从中国对虾肝胰脏中鉴定出33种能够承受低氧环境的蛋白、Silvestre F等[11]指出抗生素对斑节对虾血淋巴蛋白表达的影响会被外部养殖条件所误导。对于大西洋三文鱼、鳟鱼、鲶鱼、鳕鱼等这些具有重要商业价值的鱼种，目前研究内容主要涉及鱼类病原体或致敏蛋白、筛选表征新鲜度和品质的标记物、营养价值[12]。Lanfen Fan等[13]利用蛋白组学技术研究了对照组和处理组凡纳滨对虾血细胞中的冷应激蛋白，结果表明血蓝蛋白在凡纳滨对虾对环境的调节机制中起重要作用。张帅[14]优化了凡纳对虾肌肉双向电泳体系，采用质谱鉴定出了精氨酸激酶、肌动蛋白T2和磷酸丙酮酸水合酶这3种差异蛋白能用作新鲜度指示蛋白。李婷婷[15]筛选出8个能代表大黄鱼品质变化的差异蛋白质。李学鹏[16]采用蛋白组学技术研究中国对虾在冷藏过程中的肌肉蛋白质变化，指出腺苷钴啉胺酸合成酶可作为新鲜度指示蛋白。此外，Verrez.Bagnis等[17]利用单向和双向电泳探索黑鲈在保藏期间肌肉蛋白质变化情况，最后提出了潜在鱼肉新鲜度指示蛋白，Capillas和Moral指出鹅肌肽可以作为冰藏鳕鱼的新鲜度指示物。

蛋白质组学研究可以应用到水产品新鲜度的评价上，虽然目前有关于凡纳滨对虾蛋白组学的研究，但是对0℃冰藏这一更接近实际流通过程对虾保藏温度的研究鲜有报道。为此，作者以凡纳滨对虾为原料，以0℃作为贮藏温度，把蛋白组学技术应用到凡纳滨对虾冰藏期间肌肉蛋白的变化，旨在寻找能代表新鲜度的指示蛋白，以期探索出凡纳滨对虾肌肉蛋白质的降解情况与其品质性状之间的相关性信息。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干胶条 （24 cm，pH 4-7）：BIORAD 公司产品；蛋白酶抑制剂PMSF、二硫苏糖醇（DTT）、二硫苏糖醇 （DTT）、甘氨酸、甘油、N，N-二甲基丙烯酰胺（Acylamide）：Amresco公司产品；胎牛血清标准品BSA、N，N’- 亚 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 （N，N’ -methylenebisacrylamide）、 碳酸氢铵，Sigma公司产品；IPG Buffer（pH4-7）、水化盘、覆盖油：GE 公司产品；过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、碘乙酰胺（IAA）、硫脲（Thiourea）、脲（Urea），购于 Amersham；胰酶、三氟乙酸、低熔点琼脂糖：Promega公司产品；普通琼脂糖公司产品Gene tech companylimited公司产品；甲醇、乙腈：Fisher公司产品；HCCA：ABI公司产品；丙酮：Baker公司产品。

1.2 仪器与设备

MALDI-TOF-TOF质谱仪：德国布鲁克（Bruker Dalton）Autoflex speedTM公司产品；等电聚焦仪：GE ETTAN IPGPHOR3公司产品；垂直电泳槽：GE ETTAN DALTsix公司产品；超声仪：宁波新芝生物科技股份有限公司产品。

1.3 样品预处理

用蒸馏水将鲜活的凡纳滨对虾清洗后立即冰猝致死。置于0℃冰箱中冰藏，取样时间依次为0、2、4、6、8、10 d。

1.4 双 向 电 泳 （Two-dimensionalgel electrophoresis，2-DE）

用裂解液（20 mmol/L Tris、2 mol/L 硫脲、7 mol/L尿素、2 g/dL CHAPs）溶解、提取凡纳滨对虾肌肉第二腹节组织中的蛋白，再用分光光度计进行蛋白质定量。干胶条泡胀后进行一向等电聚焦，程序参数设置如表1所示。等电聚焦结束后，采用12.5 g/dL的二向胶进行丙烯酰胺凝胶电泳，参数设置如表2所示。

表1 等电聚焦程序参数设置Table 1 Setting of IEF parameters

表2 二向SDS-PAGE电泳参数设置Table 2 Setting of SDS-PAGE parameters

1.5 染色

本实验所用分析胶采用银染法，主要包括固定、敏化、漂洗、银染、漂洗、显色、终止和漂洗。银染的分析胶上样量一般为120 μg。作者所用质谱胶采用考马斯亮蓝染色法，以质量分数0.12%G-250、质量分数10%（NH4）2SO4和体积分数20% 甲醇为染色液。主要包括固定、漂洗、染色和终止。考染的质谱胶上样量一般为1 200 μg。

1.6 图像扫描和分析

染色完的凝胶当天扫描，采用Image Master 2D platinum 5.0（GE）专业图像分析软件读取分析二维图像数据。两组2-DE图谱中同一蛋白点的灰度值之比＞1.5，且 t-test检验p＜0.05，才可判断为差异蛋白点。当一组2-DE图谱中蛋白点灰度值高于另一组图谱中同一蛋白点灰度值1.5倍时记为上调，灰度值低于1.5倍时则记为下调。

1.7 质谱检测

利用德国布鲁克 （Bruker Dalton）Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析。参数设置：UV波长为355 nm，重复速率为200 Hz，加速电压为20 000 V，最优质量分辨率为1 500。扫描质量范围为700～3 200，收集信号。

数据库检索：利用软件 flexAnalysis（Bruker Dalton）过滤基线峰、识别信号峰。采用BioTools（Bruker Dalton）软件进行NCBI数据库搜索，寻找相关的匹配蛋白质。

2 结果与分析

2.1 凡纳滨对虾不同冰藏时间点肌肉蛋白质的2-DE图谱

采用24 cm pH4-7 IPG胶条，分析胶采用银染法，蛋白上样量为120 μg，进行等电聚焦。采用12.5 g/dL的二向胶对提取后的不同冰藏（0℃）时间的凡纳滨对虾肌肉蛋白进行2-DE分离，银染后获得清晰度和分辨率较高的蛋白质分离图谱，如图1所示。

对不同冰藏时间的肌肉蛋白质2-DE图谱依次进行两两比对。2 d与0 d对比的2-DE图谱中差异蛋白共有200个，4 d与0 d对比的差异蛋白共有190个，6 d与0 d对比的差异蛋白共有171个，8 d与0 d对比的差异蛋白共有167个。再对上述所有差异斑点进行多重比对，筛选得到2-DE图谱上相同位置的重复点所对应的差异斑点17个，依次挖取相应的斑点进行MALDI-TOF-TOF鉴定。

图1 不同冰藏时间下凡纳滨对虾肌肉蛋白质的双向电泳图谱Fig.1 2-DE gels of muscle protein of Litopeneaus vannamei during iced storage

2.2 凡纳滨对虾冰藏期间差异蛋白的鉴定与分析

在17个筛选到差异斑点中，12个蛋白斑点得到了成功的鉴定。在成功鉴定的蛋白斑点中，肌原纤维蛋白占的最多，占了1/2以上，包括肌球蛋白、肌动蛋白和肌钙蛋白。肌球蛋白和肌动蛋白属于结构蛋白，分别构成了肌原纤维蛋白的粗丝和细丝；肌钙蛋白是肌肉的主要调节蛋白质，直接参与钙所控制的肌肉收缩，占肌原纤维蛋白的5%。酶占了1/4，另外还成功鉴定出了唐氏综合症细胞粘附分子和血淋巴凝固蛋白，结果如表3所示。

从表3可以看出，一些不同的蛋白点，如斑点I19和J02、斑点I62和J29、I72和J16被鉴定为相同的蛋白，这可能是由于蛋白异构体的存在和翻译后修饰所致[18]。

表3 差异蛋白点NCBI数据库检索结果Table 3 NCBI search results of differentially expressed protein spots

为进一步筛选出随冰藏时间具有规律性变化的差异蛋白，对上述成功鉴定出的差异蛋白进行灰度值和灰度值差异倍数的分析。结果显示，初步筛选出3个随冰藏时间具有规律性变化的差异蛋白，分别为差异蛋白 I19、I14、I75。

如图2所示，差异蛋白点I19和I14的灰度值均随冰藏时间呈持续上升趋势，且这2个差异蛋白点最先的灰度值很小基本为零，说明差异蛋白I19和I14是凡纳滨对虾肌肉中固有的蛋白或酶的降解产物，这与质谱鉴定结果一致，这2个差异蛋白依次为肌球蛋白重链1和腺苷酸脱氨酶。随冰藏时间越久，肌球蛋白重链1和腺苷酸脱氨酶产生的降解产物越多，因此这些差异蛋白点灰度值也随之升高。而差异蛋白点I75为精氨酸激酶，在冰藏前期灰度值也一直上升，但到冰藏末期8 d时精氨酸激酶的降解产物本身也发生了降解，因此最后I75灰度值开始下降。无脊椎动物的精氨酸激酶与脊椎动物中的肌酸激酶类似，它属于磷酸激酶，参与细胞代谢。它将ATP上的磷酸基团转移给精氨酸，生成磷酸精氨酸和ADP，这在无脊椎动物的能量代谢中有着重要作用。

凡纳滨对虾虾肉水分含量较高，同时富含蛋白质，肌肉组织较松软，主要由肌原纤维蛋白组成[19]，其中肌球蛋白是肌原纤维蛋白的重要组成成分，构成了肌原纤维蛋白的粗丝。肌球蛋白由2条重链和4 条轻链组成，肌球蛋白重链 1（MHC1，I19）是肌球蛋白的其中一条重链。因此，凡纳滨对虾MHC1的降解会造成肌肉组织结构的崩塌和肌肉的软化，致使对虾品质下降。对虾死后肌肉发生的第一个变化是内源酶活性引起的肌肉蛋白和结缔组织的降解[20-22]，另外有文献报导指出蛋白酶水解活动能降解海鲱鱼和大西洋鳕鱼提取物中的肌球蛋白重链[23-24]。

凡纳滨对虾在冰藏期间MHC1在冰藏期间被逐渐降解，降解产物的灰度值呈上升趋势。为寻找差异蛋白在冰藏期间的变化规律，对灰度值进行线性回归，结果表明差异蛋白点I19即MHC1的灰度值变化与冰藏时间呈良好的线性正相关，决定系数R2为0.920。差异蛋白I14腺苷酸脱氨酶是嘌呤腺苷代谢中重要的酶类，它与冰藏时间用二次多项式回归拟合效果较好，决定系数R2达到0.986，而差异蛋白点I75精氨酸激酶相关性较差。不同的虾类品种在不同的贮藏条件下，虾肉的蛋白质将会发生不同的变化。李学鹏[16]在研究中国对虾4℃和-2℃冷藏过程中的肌肉蛋白质变化时，鉴定出的差异蛋白腺苷钴啉胺酸合成酶，它的灰度变化与冷藏时间有良好的线性关系，可以作为新鲜度指示蛋白。

图2 凡纳滨对虾冰藏期间差异蛋白的局部放大2-DE图谱Fig.2 Local amplification of differentially expressed protein spots in the 2-DE maps of Litopeneaus vannamei during different storage times

3 结 语

作者通过蛋白组学技术研究了冰藏期间凡纳滨对虾肌肉蛋白的变化规律，实验结果表明，肌球蛋白重链1和腺苷酸脱氨酶在冰藏期间生成的降解产物为差异蛋白I19和I14，两者的灰度值均随冰藏时间呈上升趋势。其中，差异蛋白肌球蛋白重链1的灰度值变化与冰藏时间呈良好的线性正相关，腺苷酸脱氨酶的灰度值与时间用二次多项式回归拟合效果较好。因此，肌球蛋白重链1和腺苷酸脱氨酶均对凡纳滨对虾新鲜度具有指示作用，有望成为新鲜度的指示蛋白。