墨兰“梦之兰”杂交种子无菌播种繁殖技术

张月娇

（福建省林业科技试验中心，福建 南靖 363600）

我国兰花资源丰富，已知有173属，1 240种，主要分布于云南、台湾和海南等地。我国兰属资源虽然比较丰富，但是开展杂交育种较晚，品种改良进程缓慢。近年来，随着花卉产业的发展，兰花市场也跟着蓬勃发展，但墨兰市场则显得较为冷清，这与墨兰育种工作研究不多，少有新品种发现和推出具有重要的关系[1-2]。墨兰通过杂交育种获得的一个兰花果荚约能产生1.0×104～1.0×106粒种子，但非常细小，呈粉末状，没有胚乳，只有一个弱小的胚，胚内含有很少的营养物质，绝大部分为脂类物质，外面覆盖一层不透水不透气的膜状物质，在自然环境中很不容易发芽。为能获得新品种，开展无菌播种繁殖技术研究是解决兰花种子萌发困难的有效途径。

通过以墨兰良种“梦之兰”（良种编号：闽R-SCCS-038-2014)为母本开展杂交育种，对杂交获得的果荚进行无菌播种繁殖技术研究，为墨兰的杂交育种及自主品种选育提供有利的参考依据。墨兰良种“梦之兰”杂交种子无菌播种繁殖技术还未见报道。

1 试验材料

以“梦之兰”与“大富贵”杂交获得的果荚为试验材料。

2 试验方法

2.1 杂交果荚的获得

选择母本植株花葶中上部花蕾期长势较好的花朵挂牌，每枝花葶保留1～3朵花，其余花朵全部去除，挂牌后每天观察开花情况；选取当天开放的父本花朵，取下父本蕊柱先端的药帽，取出相互粘结的花粉块备用；挑选开放3～7 d的母本花朵，将母本花朵蕊柱的花粉囊盖打开，用镊子轻轻地将花粉块取出剔除；将父本的花粉块放入母本蕊柱顶端下侧的蕊腔中，去掉授粉花朵的唇瓣，随即在授粉花朵的部位悬挂标牌，写明杂交组合父母本名称（按母本在前、父本在后）、授粉日期和操作人。授粉时遮光75%，温度24～28℃。

母本植株授粉成功的花朵子房开始膨大，逐渐发育长成果荚，定期观察果荚的发育情况，待果荚转为黄绿色且未开裂时，即可采收进行无菌播种。

2.2 外植体的消毒处理

采收后的果荚先用软毛刷轻轻刷去附着于表面的灰尘等杂质，用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行表面清洁，清水冲洗干净，晾干后用锋利的刀片切除花梗、残留的柱头等，装进广口瓶中，置无菌超净台上进行消毒处理，首先用75%酒精消毒30～60 s，无菌水冲洗2次后，再用0.1%的HgCl2振荡消毒10～20 min，无菌水冲洗5次以上，沥干水分备用。

2.3 原球茎诱导培养基的选择

在超净工作台上，取出消毒后的果荚，吸干附着于表面的水分，用解剖刀切去果荚上下两端的柱头和果柄，剖开果荚，将种子播撒在诱导培养基中。诱导培养基以因素基本培养基（改良MS、MS、KC）、6-BA(1.0、2.0、3.0 mg·L-1)和NAA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）为试验因子，采用正交表L9(34)安排试验[3]（表1），共9个试验号，每个试验号接种30瓶，180 d后调查统计原球茎萌发数和萌发率，筛选最佳诱导培养基配方。

2.4 原球茎增殖培养基的选择

在诱导培养基中，挑选出生长健壮、大小均匀的原球茎，接种于因素基本培养基（改良MS、MS、KC、B5），6-BA(1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1)、KT（1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1）、NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1），采用正交表L16(45)安排试验（表3），每个试验号接种30瓶，60 d后调查统计其增殖倍数，筛选最佳增殖培养基配方。

2.5 原球茎分化培养基的选择

将生长健壮的原球茎接种于以改良MS为基本培养基，附加不同浓度的因素6-BA(2.0、3.0、4.0 mg·L-1)、KT(2.0、3.0、4.0 mg·L-1)、NAA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1），采用正交表L9(34)安排试验（表5），每个试验号接种30瓶，60 d后观察并统计原球茎分化出芽情况，筛选出最佳分化培养基配方。

2.6 生根壮苗培养基的选择

当分化出的芽苗长至3 cm以上时，即可接种于以改良1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的因素NAA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）、IBA(1.0、1.5、2.0 mg·L-1)、AC（1.0、1.5、2.0 g·L-1），采用正交表L9(34)安排试验（表7），每个试验号接种10瓶，每瓶接种10株小苗，50 d后调查统计平均生根数，筛选出最佳生根培养基配方。

2.7 培养条件

果荚无菌播种后在诱导培养、继代增殖培养、分化培养和生根培养时，先进行7 d的暗培养后，再在培养室中进行光照培养，光照时间为12 h·d-1、温度为（25±2）℃、光照强度为2 000 lx[4]，各阶段的培养基糖用量为30 g·L-1，pH值为5.0～5.5。

3 结果与分析

3.1 不同基本培养基和激素浓度对原球茎诱导影响

种子播种后，为保持培养空间的洁净，7 d后需及时剔除污染的接种瓶。种子在播种3个月后，部分种子开始肿胀萌发，慢慢形成乳白色的球状体，球状体渐渐变大变绿，部分长出白色的绒毛[5-6]，播种6个月后，统计原球茎个数和萌发率，结果见表1。

表1 原球茎诱导培养正交试验结果与分析Tab.1 Orthogonal test analysis results of protocorminduction culture

从表1的结果可以看出，各个试验号均能诱导出原球茎，试验3号（改良MS+6-BA 3.0mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1）诱导出的原球茎数最多（48个），从极差可以看出6-BA对试验结果的影响最大，其次是基本培养基，再次是因素NAA；从萌发率可以看出，试验3号（改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1）的萌发率最高（87%），从极差可以看出，6-BA对萌发率的影响最大，其次是基本培养基，再次是NAA。从不同激素浓度看，随着6-BA和NAA的浓度升高，原球茎分化数和萌发率逐步增加，从各水平的结果看，当6-BA的浓度为3.0 mg·L-1、NAA的浓度为1.5 mg·L-1时，其原球茎诱导数和萌发率的结果值最高。因此，得出墨兰梦之兰杂交果荚原球茎诱导的最佳培养基为改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1。

各因素对试验结果的影响进行方差分析，结果见表2。

表2 原球茎诱导培养正交试验方差分析表Tab.2 Protocorm induced culture orthogonal test ANOVA

从表2的方差分析可以看出，基本培养基在原球茎诱导中的F值为256.00，大于F0.01,达到极显著水平，6-BA在原球茎诱导中的F值为304.00，大于F0.01，达到了极显著水平；在萌发率方差分析中，基本培养基的F值为50.08，大于F0.05小于F0.01，达到了显著水平，6-BA的F值为59.15，大于F0.05小于F0.01，达到了显著水平；NAA在原球茎诱导的F值为17.71，在萌发率的F值为6.08，均小于F0.05，表明NAA对原球茎的诱导和萌发率的影响不显著。

3.2 不同基本培养基和激素浓度对原球茎增殖影响

原球茎在增殖培养基中继续膨大，30 d后开始分裂出一些白色球状物；随着培养时间的增长，白色球状物渐渐变大变绿[7]，接种60 d后统计原球茎增殖倍数，结果见表3。

表3 原球茎增殖培养正交试验结果与分析Tab.3 Protocorm proliferation culture orthogonal test results

从表3中可以看出，各处理对原球茎的增殖均有一定的影响，从各试验号来看，以试验3号的增殖倍数最高（3.9）；其次为试验4号和试验8号，增殖倍数均为3.2。从R值可以看出，基本培养基对增殖倍数的影响最大，其次是KT,再次是NAA。从K值可以看出，基本培养基的第1水平最好，6-BA的第3水平最好，KT的第4水平最好，NAA的第3水平最好，由此，原球茎增殖的最佳培养基为改良MS+6-BA 2.0 mg·L-1+KT 2.5 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1。

对原球茎增殖的试验结果进行方差分析，结果见表4。

表4 原球茎增殖培养正交试验方差分析表Tab.4 Protocorm proliferation culture orthogonal test ANOVA table

由表4可以看出，基本培养基和KT的F值均大于F0.05小于F0.01，说明基本培养基和KT对原球茎的增殖影响显著，6-BA和NAA的F值均小于F0.05，说明6-BA和NAA对原球茎的增殖影响不显著。

3.3 不同激素浓度对原球茎分化的影响

原球茎在分化培养基中，培养30 d后有白色芽点冒出，芽点慢慢变绿，叶原基逐渐发育长出幼叶，形成单株小苗，60 d后统计萌芽株数，结果见表5。

表5 不同激素浓度对原球茎分化的影响Tab.5 Effects of different hormone concentraitions on protocorm differentiation

从表5可以看出，不同激素浓度组合均能使原球茎分化出苗，其中试验5号的萌芽株数最多（89株），从R值可以看出，KT的R值最高，表明KT对原球茎分化的萌芽数影响最大，其次是NAA，再次是6-BA。从K值可以看出，6-BA的第2水平最好，KT的第2水平最好，NAA的第3水平最好。

对原球茎分化试验结果进行方差分析，结果见表6。

表6 原球茎分化正交试验方差分析表Tab.6 Protocorm differentiation orthogonal test ANOVA

从表6可以看出，因素6-BA、KT、NAA的F值均大于F0.05I小于F0.01,表明各因素对原球茎的分化均有显著影响。从各因素的最优水平可以得出，原球茎分化最佳培养基配方为改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+KT 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1。

3.4 生根壮苗培养基的选择

将原球茎分化出带有3片以上叶子、高3 cm以上的小苗接种于生根壮苗培养基中，20 d后，小苗基部有白色根点形成，50 d后统计平均生根数，结果见表7。

表7 不同因素对生根壮苗影响的结果Tab.7 Effects of different factors on rooting and seedlings

从表7中可以看出，各试验号均能诱导出不定根，其中试验5号诱导出的根数最多，平均生根数可达3.1条，从R值可以看出，IBA对诱导生根数的影响最大，从各水平的K值看，因素NAA的第2水平最好，因素IBA的第2水平最好，因素AC的第3水平最好。

对生根壮苗的试验结果进行方差分析，结果见表8。

表8 不同因素对生根壮苗影响的方差分析表Tab.8 ANOVA table of different factors affecting rooting

从表8可以看出，IBA和AC对试验结果有显著影响，NAA对试验结果影响不显著。因此，结合各因素的最优水平看，梦之兰杂交种子生根壮苗的最适培养基为改良1/2MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 1.5 mg·L-1+AC 2.0 mg·L-1。当培养基中的小苗根长至1 cm以上时，即可移到炼苗大棚进行移栽炼苗。

4 讨论与结论

兰花种子在自然条件下萌发较为困难，主要与其胚发育不完全、种皮致密透气性差和种皮中含有抑制物有关。而通过组织培养技术对果荚进行无菌播种可有效获取兰花幼苗，是兰花杂交育种和兰花产业发展的关键技术之一[8-9]。前人在兰花的无菌播种方面也有一些报道，如蓝炎阳等[10]使用MS为基本培养基，植物生长调节剂为6-BA和NAA，在种子萌发培养基中添加了活性炭，壮苗生根培养基中添加了香蕉泥和活性炭，建立了大花蕙兰和墨兰杂交种子的无菌播种方法，获得了种子萌发、根状茎增殖与分化、壮苗生根培养基的最适配方。张小娟等[11]运用MS培养基，附加植物生长调节剂6-BA和NAA，建立了墨兰种子无菌播种方法。陈汝民[7]等通过对墨兰种子、原球茎和根状茎的培养，获得了墨兰的幼苗。墨兰“梦之兰”是墨兰的一个新品种，其杂交种子无菌播种繁殖技术还未见有报道，本研究系统介绍了以“梦之兰”为母本开展杂交育种的过程和方法，对杂交种子无菌播种繁殖技术做了深入的阐述。研究发现，墨兰“梦之兰”杂交种子无菌播种基本培养基的主要组成也是MS培养基、6-BA和NAA，可见MS、6-BA和NAA是兰花无菌播种培养方法中的关键成分。但通过对MS基本培养基中的大量元素进行改良，对各培养阶段附加的激素浓度进行优化组合研究，获得了原球茎诱导的最佳培养基为改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1，原球茎增殖培养最佳培养基为改良MS+6-BA 2.0 mg·L-1+KT 2.5 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1，原球茎分化最佳培养基为改良MS+6-BA 3.0 mg·L-1+KT 3.0 mg·L-1+NAA 1.5 mg·L-1，生根壮苗培养最佳培养基为改良1/2MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 1.5 mg·L-1+AC 2.0 g·L-1，研究结果显示，利用优化后的培养基配方可获得大量有效的杂交子代幼苗。

兰花无菌播种受诸多因素的影响，每一个环节都可能影响最终的成苗。在实际操作中主要需注意如下几点：（1）诱导原球茎时，同一果荚的种子同时播种在相同的培养基中其萌发时间不一致，萌发时间间隔较长，在实际操作中，可将先萌发出的原球茎转接到增殖培养基中，未萌发种子转接到诱导培养基中继续萌发；（2）原球茎增殖培养时，增殖的原球茎必须及时进行转接，一般不宜超过90 d，否则会逐渐褐化死亡；（3）原球茎分化培养时，分化出的小苗长至3 cm高带有3片叶子时即可转接到生根培养基中进行生根培养，其余的原球茎转接到分化培养基中继续培养。