直接抗病毒药物治愈的慢性丙型肝炎患者NK细胞的免疫学特点分析

周文靖，史继静，李元元，王福生

慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C,CHC）是由HCV感染引起的一种严重威胁人类健康的传染性疾病。病毒持续复制，机体HCV特异性免疫功能低下，诱发肝脏组织发生天然免疫和适应性免疫的损伤是CHC发生的主要病理基础[1-2]。机体适应性免疫尤其是细胞免疫在清除病毒过程中起重要作用，但天然免疫亦是机体抗HCV感染不可或缺的关键部分[3]。NK细胞作为机体天然免疫系统的主要成分，不仅在HCV感染早期病毒的自发性清除中发挥重要作用[4]，还与慢性感染阶段抗病毒治疗效果有关[5]。当前，临床采用直接抗病毒药物（direct-acting antivirals,DAAs）可以治愈CHC，且疗程短、服用方便、安全性好，较干扰素抗病毒治疗具有极大的优势[6]。DAAs治疗已逐渐替代聚乙二醇干扰素- α/利巴韦林方案，成为国内外治疗CHC的主要手段。

目前有关DAAs治疗慢性HCV感染的研究较多集中在临床疗效方面，有关机体免疫学变化的研究较少。本研究对接受达拉他韦（daclatasvir,DCV）和阿舒瑞韦（asunaprevir,ASV）治疗的初治型HCV 1b型CHC患者外周血NK细胞表型和功能进行研究，以探索DAAs治疗对机体NK细胞免疫学特点的影响。

1 对象与方法

1.1 对象与材料

1.1.1 对象 纳入2015年9月 2016年11月于原解放军第三〇二医院门诊就诊，且接受DCV/ASV治疗的初治型HCV 1b型CHC患者13例。入组标准：①年龄≥18周岁；②仅为HCV 1b型感染；③初治受试者定义为既往未曾暴露于任何干扰素制剂、利巴韦林和DAAs；④筛选时HCV RNA≥104IU/ml ；⑤HIV-1和血清HBsAg阴性。排除标准：①有证据显示除HCV感染以外的疾病所导致的慢性失代偿性肝病，包括但不限于腹水、静脉曲张出血或肝性脑病；②确诊或疑似肝细胞癌或其他恶性肿瘤；③TBIL≥2 mg/dl（34 μmol/L）；④ ALT ≥ 5×ULN；⑤白蛋白＜3.5 g/dl（35 g/L）； ⑥ AFP ＞ 100 ng/ml（82.6 IU/ml）或AFP≥50 ng/ml且≤100 ng/ml（≥41.3 IU/ml且≤82.6 IU/ml）的受试者须进行肝脏超声检查，如疑似肝细胞癌则应排除；⑦HGB＜8.5 g/dl（85 g/L）；⑧中性粒细胞绝对计数＜0.5×109/L；⑨PLT＜50×109/L；⑩未受控制的糖尿病或高血压；中、重度抑郁症。所有患者均接受24周的DCV/ASV治疗，治疗结束后随访24周。另纳入健康对照（healthy control,HC）13例（表1）。入组的所有受试者均签署知情同意书。

表1 入组患者和健康对照的基线临床资料Table 1 Baseline clinical data for enrolled CHC patients and healthy controls

1.1.2 材料 鼠抗人CD3-BV421、CD56-Percp、CD56-BV510、CD16-FITC、HLA-DR-BV421、CD38-PE-cy7、NKP46-BV510、NKP30-BV421、IFN-γ-PE-cy7、TNF-α-PE 等荧光抗体均购自美国Biolegend公司；鼠抗人NKG2A-PE购自美国R&D公司；CD107a-FITC荧光抗体、Golgistop、破膜剂及破膜洗液均购自美国BD公司；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、RPMI 1640培养液均购自美国Gibco公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）、离子霉素（ionomycin,IONO）、1%多聚甲醛均购自美国Sigma公司；淋巴细胞分离液购自天津美德太平洋公司；IL-12购自美国PeproTech公司；IL-18购自美国Biovision公司；HCV核酸定量检测试剂盒购自湖南圣湘生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HCV核酸定量检测 使用HCV核酸定量检测试剂盒定量检测HCV RNA水平，该试剂盒的定量下限为50 IU/ml，检测下限为25 IU/ml，HCV RNA＜25 IU/ml定义为检测不到。

1.2.2 外周血单个核细胞的分离与冻存 分别于CHC患者接受治疗第0周、1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周、16周、24周及治疗结束后随访第4周、12周、24周采集EDTA抗凝外周静脉血，另外分别采集13例HC外周抗凝静脉血，1500 r/min离心10 min，留取血浆，将剩余细胞悬液用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离获取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），用含90%FBS和10%DMSO的细胞冻存液进行冻存。

1.2.3 NK细胞表型分子流式染色 复苏冻存的PBMCs，调整浓度为 5×106/ml，取 100 μl置于流式管中加入表型抗体（CD3、CD56、CD16、CD38、HLA-DR、NKP30、NKP46、NKG2A），混匀，室温避光孵育25 min；加入1 ml PBS，混匀，离心洗涤，1500 r/min，5 min；弃上清，拍干；用200 μl 1%多聚甲醛液重悬细胞，4 ℃避光保存，24 h内用流式细胞仪检测。

1.2.4 NK细胞脱颗粒（CD107a）和释放IFN-γ、TNF-α检测 复苏冻存的PBMCs，用含10%FBS的RPMI-1640细胞培养液重悬，按5×105/孔铺入96孔细胞培养板中；向指定培养孔内分别加入刺激因子 [PMA（50 ng/ml）+IONO（1 μg/ml）、IL-12（50 ng/ml）+IL-18（50 ng/ml）]，同时向每孔加入 Golgistop（10 μg/ml）和鼠抗人CD107a荧光抗体，混匀，放入37 ℃ CO2细胞培养箱孵育6 h；收集细胞至流式管中，加入1 ml PBS，震荡混匀，1500 r/min离心5 min洗去刺激剂；弃上清液，加入表型抗体（CD3、CD16、CD56），避光孵育25 min；PBS洗涤后加入破膜剂，4 ℃避光破膜30 min；破膜洗液洗涤后加入IFN-γ、TNF-α单抗，避光孵育25 min；破膜洗液洗涤后，用300 μl 1%多聚甲醛液重悬细胞，4 ℃避光保存，24 h内用流式细胞仪检测。

1.2.5 统计学处理 使用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，并用GraphPad Prism 6.0进行图形绘制。定量资料以中位数（最小值，最大值）表示，CHC患者与HC各不同治疗时间点之间的比较采用Mann-Whitney非参数U检验，CHC患者不同治疗时间点之间的两两比较采用Wilcoxon配对符号秩检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DCV/ASV治疗过程中CHC患者血清HCV RNA水平 对13例患者进行DCV/ASV抗病毒治疗，并在治疗过程中动态监测患者血清HCV RNA水平。结果显示，13例患者治疗前的HCV RNA水平为6.82（4.31，7.29）log IU/ml，所有患者在接受DCV/ASV治疗2周内血清HCV RNA均下降至检测不到的水平（HCV RNA＜25 IU/ml），并一直维持到随访结束。

2.2 DCV/ASV治疗的CHC患者NK细胞表型变化 外周血NK细胞表型检测分析结果显示，与HC组相比，CHC患者治疗前外周血NK细胞活化程度较高，表达HLA-DR（U=43.000，P=0.037）（图1A）、CD38（U=39.500，P=0.023）（图1B）和NKP46（U=13.000，P＜ 0.001）（图1C）的水平显著升高；表达NKP30（图1D）和NKG2A（图1E）的水平无明显差异。接受DAAs治疗后HLA-DR的表达水平显著下降，且与HC组无显著性差异（图1A）。随访结束时NKP46的表达水平较治疗前显著下降（Z=84.000，P=0.007），但仍高于HC组（U=31.000，P=0.008）（图1C）。

图1 DCV/ASV治疗的CHC患者NK细胞表型分析A～E.DCV/ASV治疗的CHC患者NK细胞HLA-DR、CD38、NKP46、NKP30、NKG2A的表达水平；0.治疗第0周（治疗前）；24.治疗第24周；FU 12 、FU 24.治疗结束后随访第12周、24周；*.P＜0.05Figure 1 Phenotypic analysis of NK cells in CHC patients treated with DCV/ASV

2.3 DCV/ASV治疗的CHC患者NK细胞毒性和功能的检测 在体外分别用PMA+IONO、IL-12+IL-18刺激来源于CHC患者和HC的PBMCs，通过流式细胞术检测NK细胞分泌CD107a、IFN-γ和 TNF-α的能力。结果显示：IL-12+IL-18刺激下，CHC患者治疗前分泌CD107a（U=16.000，P=0.002）和 TNF-α（U=36.000，P=0.040）的能力均较HC显著增高（图2A、2C），产生IFN-γ的能力显著降低（U=28.000，P=0.012）（图2B）；DAAs治疗后，CHC患者在随访12周时CD107a的表达水平较治疗前有显著下降（Z=3.000，P=0.005）但仍高于HC（U=33.000，P=0.026），随访结束时与HC无明显差异（图2A）；CHC患者NK细胞产生IFN-γ的能力在DAAs治疗后明显增强（Z=71.000，P=0.012）（图2B）。PMA+IONO刺激下，3种细胞因子的表达水平在组间及组内不同时间点无明显差异（图3）。

图2 IL-12+IL-18刺激下DCV/ASV治疗的CHC患者NK细胞毒性和功能的变化A～C.IL-12+IL-18刺激下DCV/ASV治疗的CHC患者NK细胞分泌细胞因子CD107a、IFN-γ和TNF-α的能力；0.治疗第0周（治疗前）；24.治疗第24周；FU 12 、FU 24.治疗结束后随访第12周、24周；*.P＜0.05Figure 2 Changes of NK cells cytotoxicity and function in CHC patients treated with DCV/ASV in response to IL-12 +IL-18 stimulation

图3 PMA+IONO刺激下DCV/ASV治疗的CHC患者NK细胞毒性和功能的变化A～C.PMA+IONO刺激下DCV/ASV治疗的CHC患者NK细胞分泌细胞因子CD107a、IFN-γ和TNF-α的能力；0.治疗第0周（治疗前）24.治疗第24周；FU 12 、FU 24.治疗结束后随访第12周、24周Figure 3 Changes of NK cells cytotoxicity and function in CHC patients treated with DCV/ASV in response to PMA +IONO stimulation

3 讨 论

天然免疫是机体抗病毒感染的第一道防线，对控制病毒感染和有效启动获得性免疫至关重要。NK细胞是天然免疫系统的重要组成成分，在HCV感染的各阶段均发挥着关键作用[7]。有研究表明，慢性HCV感染阶段患者NK细胞的活化程度增高、细胞毒性增强，但分泌IFN-γ的能力受损，不利于病毒的清除[8-10]。

DAAs的出现使CHC患者得以治愈，但DAAs治疗对机体免疫系统的影响目前仍不十分清楚。有研究显示，DAAs介导的HCV清除伴随有NK细胞免疫学功能的变化[11-15]。但亦有学者报道DAAs治疗后，CHC患者NK细胞的免疫学变化尚不确定，仍须进一步讨论[16]。

HCV 1b型是我国HCV感染最常见的基因型[17]，DCV/ASV作为国内首个获批的DAAs联合治疗方案，对HCV 1b型CHC患者治愈率高、安全性与耐受性良好。本研究发现13例CHC患者接受DCV/ASV治疗24周后均获得持续病毒学应答。对其免疫学特点进行分析发现，CHC患者治疗前外周血NK细胞表达HLA-DR、CD38、NKP46、CD107a的水平显著增高，表达IFN-γ的水平显著降低，表明CHC患者外周血NK细胞活化程度增高，细胞毒性增强，但产生IFN-γ的能力减弱，这与既往研究报道一致[8-10]。此外，我们通过对DAAs治疗的患者不同随访时间点的外周血NK细胞表型和功能特点进行比较，发现治疗后患者NK细胞HLA-DR、NKP46、CD107a的表达水平显著下降，同时IFN-γ的表达水平显著升高，表明DAAs治愈的CHC患者外周血NK细胞的活化程度和细胞毒性降低，分泌IFN-γ的能力增强。同时，本研究还发现，CHC患者在接受DAAs治疗前及治疗过程中NK细胞表达NKP30和NKG2A的水平并未发生明显改变，这与既往的研究结果不同，先前研究认为CHC患者治疗前外周血NK细胞表达NKP30和NKG2A的水平显著增高，且经DAAs治疗之后其表达水平均显著下降[11-12，14]，造成这种差异的原因可能与入选病例的种族、治疗经历、HCV基因型及采用DAAs治疗方案的不同有关。

总之，本研究发现DAAs在快速抑制CHC患者体内HCV达到治愈水平的同时，伴随NK细胞免疫功能的变化。然而，由于入组病例数较少，患者感染的HCV基因型及采用的DAAs治疗策略单一，研究存在着一定的局限性，有关DAAs治疗对机体免疫系统的影响及其具体机制有待进一步探索与验证。