火针对膝骨关节炎大鼠关节软骨MMP-3、TGF-β1、TNF-α的影响①

刘艳伟 孟爱霞 胡 华 李连泰 杜志峰 王书君 徐 昆

(承德医学院附属医院骨伤科，承德067000)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是最常见的关节退行性疾病，我国成年人中膝骨关节炎的患病率高达9.6%。随着社会人口老龄化，本病的发生率也将越来越高[1]。由于关节软骨损伤后很难修复，严重影响关节功能的恢复，导致治疗周期长，给患者的生活带来严重影响。因此，如何修复损伤的关节软骨，恢复关节功能，成为临床康复医学棘手的问题。研究显示，MMP-3、TGF-β1和TNF-α在关节软骨损伤及修复过程中发挥着重要作用[2，3]。MMP-3是MMPs家族的主要成员之一，能分泌大量的细胞外分子，降解细胞外基质膜成分，参与膝骨关节炎病程发展的重要物质[4]。TNF-α是一种血管生成多肽因子，与软骨组织的破坏关系密切。TGF-β1属于转化生长因子，膝骨关节炎患者常表现出高表达，同时也是病情加重的重要促进因素[5]。KOA的临床治疗主要是改善相关症状，非甾体抗炎药是常用药物，但长期服用常引起副作用，如胃肠道不适等。临床研究表明：针灸在缓解患者膝关节炎引起的疼痛、肿胀等方面有显著疗效，但具体机制尚不明确[6，7]。火针临床治疗膝骨关节炎疗效显著，具有舒筋通络、止痛、消肿的功效。本研究旨在探讨火针对KOA大鼠关节软骨MMP-3、TGF-β1、TNF-α的影响。

1 材料与方法

1.1材料 30只6周龄雄性SPF级SD大鼠,体质量(250±20)g,河北省医科大学实验动物中心提供,实验动物许可证号：SCXK(冀)2014-001。实验过程中对大鼠的处置严格遵守国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。转化生长因子β1放免试剂盒、肿瘤坏死因子α放免试剂盒、基质金属蛋白酶3放免试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；石膏绷带(浙江义乌诺医疗卫生用品有限公司)；火针(北京中国针灸研究所)。lympus光学显微镜(日本BHS)；Neofuge 15R台式高速冷冻离心机(Heal Force)；DV800型全自动生化测定仪(美国Bechman公司)。

1.2方法

1.2.1分组 将30只大鼠随机分为正常组10只，模型组20只。参考文献[2]方法，模型组采用后肢伸直位固定法造模。造模前12 h禁食，麻醉后剃去后肢髋关节至脚趾毛，踝关节背屈70～90度，伸展膝关节至160～180度，纱布固定，将石膏从腹股沟至脚趾缠绕大鼠后肢，脚趾露出，绷带固定。每日2次观察制动情况及其脚趾血流情况，6周后解除束缚，观察大鼠行为学改变，后肢膝关节肿胀情况，对局部按压的疼痛反应程度等各方面进行程度评分。将20只KOA模型大鼠随机再分为模型组、火针组。正常组和模型组给予正常饮食，不作任何治疗。火针组参照《实验针灸学》，选取膝前穴、阿是穴和阳陵泉穴，在穴位上涂一层薄薄的万花油，在酒精灯的外焰将贺氏火针烧至红白，迅速点刺入1～2 mm，然后迅速拔出，干棉球按压针孔片刻，每3 d行一次针，共治疗6次。

1.2.2Lequesne MG评分 造模结束后及最后一次火针后的次日即对全部大鼠进行评分，观察其后肢膝关节肿胀情况，局部按压疼痛反应、步态、关节可自由活动的角度等方面由同一观察者进行操作评分。

1.2.3标本采集 脱颈处死各组大鼠，收集腹主动脉血，固定大鼠，伸直关节，切开皮肤，取下整个膝关节，观察软骨平面状况，0.9%生理盐水冲洗，然后一份置于4%中性甲醛中，另一份液氮冻存后转入-80℃冰箱保存，备用。

1.2.4血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α检测 取出-80℃冰箱血清样品，按照试剂盒操作步骤，采用全自动生化检测仪酶联免疫法测定各组大鼠血清中MMP-3、TGF-β1和TNF-α水平。

1.2.5大鼠膝关节软骨组织HE染色观察 大鼠膝关节软骨组织置于4%甲醛溶液中固定24 h，70%、80%、90%和100%梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，二甲苯透化，脱蜡，蒸馏水冲洗，进行HE染色，利用倒置显微镜观察膝关节软骨病理组织形态结构。

1.2.6放射免疫检测软骨组织中MMP-3、TGF-β1和TNF-α 取-80℃冰箱保存的大鼠膝关节软骨组织，称重后加入9倍量0.9%生理盐水，匀浆，4℃下3 000 r/min离心15 min，取上清液，按照放免试剂盒操作步骤进行放射免疫检测，测定各组大鼠膝关节软骨中MMP-3、TGF-β1和TNF-α水平。

2 结果

2.1各组大鼠Lequesne MG评分 治疗前，与正常组比较，模型组和火针组大鼠Lequesne MG评分差异有显著统计学意义(P<0.05)；治疗后，与模型组和治疗前比较，火针组大鼠评分明显较低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。表明火针治疗可明显有效缓解KOA大鼠症状，对膝骨关节炎大鼠的行为学状态具有明显的改善作用。

2.2各组大鼠血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α表达水平 与正常组比较，模型组大鼠血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，火针组大鼠血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α表达水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3各组大鼠膝关节软骨组织HE染色形态 显微镜下显示：正常组大鼠膝骨关节软骨表面光滑，细胞排列有一定规则，潮线清晰可见；模型组大鼠膝骨关节软骨表面粗糙，软骨细胞肥大，表层细胞坏死，巢状增生，潮线消失，呈现明显退行性病变；火针组大鼠膝骨关节软骨表面较光滑，细胞排列规则，表层细胞轻度增生，潮线较完整。见图3。

GroupsnBefore treatmentAfter treatmentControl1000Model108.41±0.861)7.18±0.671)Heated needle108.38±0.911)3.52±0.542)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

GroupsnMMP-3TGF-β1TNF-αControl1019.98±1.2415.11±1.0221.75±0.67Model1040.01±2.731)31.78±2.551)66.86±1.001)Heated needle1026.45±2.912)20.01±1.922)25.82±0.532)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

2.4放射免疫检测各组大鼠软骨组织中MMP-3、TGF-β1和TNF-α 与正常组比较，模型组大鼠膝关节软骨组织中MMP-3、TGF-β1和TNF-α含量均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，火针组大鼠膝关节软骨组织MMP-3、TGF-β1和TNF-α含量均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。表明火针治疗能通过降低过度表达的MMP-3、TGF-β1和TNF-α使其发挥对膝关节软骨细胞的促修复作用。

3 讨论

KOA是一种以软骨进行性关节软骨变性、破坏，伴随骨质增生反应的退行性疾病，以膝关节疼、肿胀、活动障碍为主要临床表现，是临床最常见的关节疾病之一，近年来发病率呈逐年上升趋势[8]。现代医学认为，软骨合成降解因子水平降低、促合成因子水平增高是引起KOA的重要原因，而炎症因子水平紊乱是该病发展的重要推动因素[9]。KOA属于传统中医学“骨痹”、“痹证”、“膝痹”等范畴，多因风寒之邪引起，患者常表现出下肢畏寒、得温痛减等症状[10，11]。针刺是中医治疗的重要组成部分，是临床治疗膝骨关节炎的常用手段，具有疏通经络气血、消肿止痛之功，广泛用于KOA的治疗，临床疗效显著。火针是针灸的一种，可温经散寒、消肿止痛、通经活络、巧腐生新，能够有效改善KOA症状。阳陵泉穴为八会穴之筋会，为治疗筋病的要穴，具有强健腰膝、壮筋补虚功能；膝前及阿是穴能疏通局部经气、行气活血祛瘀。林国华等[12]发现“膝前穴、阿是穴、阳陵泉穴”三穴行使火针能抑制小鼠KOA病变发展，明显改善膝关节灵活性。但目前火针对膝骨关节炎的治疗作用相关机制少见报道，本研究选取膝前穴、阿是穴和阳陵泉穴火针治疗6次后发现KOA模型大鼠膝骨关节软骨表面较光滑，细胞排列规则，表层细胞轻度增生，潮线较完整，表明火针可改善KOA大鼠膝关节软骨细胞排列情况，进而改善软骨表面光滑度，达到治疗目的，为火针的临床应用提供实验依据。

图1 各组大鼠膝骨关节软骨组织HE染色(×100)

GroupsnMMP-3(μg/mg)TGF-β1(pg/mg)TNF-α(pg/mg)Control109.11±0.121.44±0.136.79±0.88Model1021.48±0.391)3.37±0.221)12.03±1.011)Heated needle1012.61±0.222)2.10±0.192)8.23±0.732)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

MMP-3是MMPs家族的主要成员之一，在膝骨关节炎、心血管疾病等疾病过程中起到重要促进作用，MMP-3是直接作用于膝关节软骨细胞外基质的蛋白分解酶，导致其细胞外基质蛋白质降解，加速软骨代谢分解，加重膝关节软骨组织进一步损伤[13]。TGF-β1属于转化生长因子，与骨性关节炎发生发展密切相关，同时也是病情加重的重要促进因素。TGF-β1具有多种生物学作用：①促进细胞外基质蛋白质降解；②趋化单核细胞和成纤维细胞；③促进成骨细胞和成纤维细胞生长[14]。TNF-α是一种血管生成多肽因子，一方面其对软骨细胞有极强的分解破坏作用，另一方面还可抑制软骨基质合成。研究显示，TNF-α可诱导产生前列腺素E2，前列腺素E2不仅可以直接对软骨下骨产生分解，而且可以诱导激活MMPs，对软骨基质的纤维结构重建造成严重阻碍作用[15-17]。本研究结果显示，KOA模型大鼠血清和软骨组织中MMP-3、TGF-β1和TNF-α表达水平均显著升高，表明造模引发大鼠膝关节局部无菌性炎症，诱发TNF-α大量表达，激活基质金属蛋白酶原，导致MMP-3、TGF-β1含量升高。经火针治疗后，KOA大鼠膝关节软骨中MMP-3、TGF-β1和TNF-α明显低于模型组，表明火针干预治疗可抑制破坏因子的表达。

综上所述，本研究结果显示火针治疗可有效减轻大鼠膝关节软骨损伤，降低血清及膝关节软骨组织中MMP-3、TGF-β1和TNF-α水平，这可能是火针治疗膝骨关节炎的一个作用机制。