珍稀克隆植物北极花有性繁殖状态及传粉模式研究∗

何爽，翟雅芯，王德萍，侯真珍，张爱勤†

(1.新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐830047;2.克拉玛依市高级中学，新疆 克拉玛依834000; 3.新疆九洲熏蒸消毒有限责任公司，新疆 乌鲁木齐830011)

0 引言

繁殖是生物繁衍后代延续种族最基本的行为和过程，对于兼性繁殖的克隆植物来说，有性繁殖常被认为是适应不稳定环境和物种地理迁移的重要手段[1].然而，受生态和遗传条件影响，有性繁殖在不同物种间，以及在同一物种的不同分布区间均存在巨大差异.克隆繁殖有助于植物在异质性生境中扩张空间、捕获资源，但是，较大的克隆投资无形中增加了对有性繁殖的对抗，一些物种由于克隆生长使得有性繁殖显得极为脆弱，甚至濒危[2,3].植物有性与无性繁殖间的冲突之一是两种繁殖方式间的分配权衡，以及克隆繁殖对花粉扩散和交配系统所产生的影响[4,5].克隆生长一定程度增加了花展示，但同时也增加了同株异花授粉的比例和克隆株内花粉的传递.很多自交不亲和的克隆植物因为自花传粉比例过高而导致有性繁殖受阻[6−8].在低温的高山环境，克隆植物的有性繁殖还受传粉者数量、种类、访花行为的限制.

北极花（Linnaea borealisL. ）是位于北半球高寒地带的单种属忍冬科北极花族植物，主要分布在北美和欧亚等地，具克隆生长习性，由于分布区的不断缩小，在苏格兰等地已被定为濒危物种[9].在我国目前仍做为珍稀种被记载[10].已报道的对苏格兰分布区北极花的研究显示，自然居群的结实率在0∼25%之间，居群的片断化以及大克隆斑块中亲和花粉的缺乏是导致有性繁殖受阻的主要原因[2,11].而在斯堪的纳维亚半岛，居群自然结实率在24∼60%之间，表现出不同分布区结实状况的较大差异.位于新疆北部的北极花居群为欧亚分布区的边缘居群.空间的分离和环境因子的差异，使得新疆境内的北极花居群有着怎样的有性繁殖状态和传粉模式是一个值得探讨的问题.前期观测显示作为游击型克隆植物的北极花访花者并不少，结实初期也有着很高的结实率，而到后期却大量脱落，其影响因素并不清楚.为此，本文从北极花的开花习性、花部特征、传粉昆虫的访花行为及结实格局等方面对其进行研究，以探讨北极花的有性繁殖状态及其在花粉传递方面的影响因素.同时，为植物繁育系统多样性的研究及世界范围内珍稀、濒危物种的保护与交流提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 研究地点及试验材料

研究地点位于喀纳斯国家自然保护区内(86°55′E ∼87°03′E 48°36′N ∼48°42′N)，海拔1 500 ∼2 000m的针叶林下.年均气温4◦C左右，7月份平均气温15∼20◦C，属温带高寒山区气候.

研究材料北极花为匍匐状的常绿小灌木, 具游击型克隆构型，主茎柔软细长，分株须根在3∼5cm 的土层内.每花序具2 花，双悬垂，粉红色或粉白色，花果期在6∼8 月.与伴生种越橘(Vaccinium vitis-idaeaL. )、镰状卷耳（Cerastium bungeanumVyed.）、独丽花（Moneses uniflora(Linn.) A. Gray）等的花期有重叠.研究时间为2014∼2016年的花期和结实期.

1.2 研究方法

1.2.1 开花物候及开花习性的观测

花期，随机标记不同植株上即将开放的花序和单花各15个（朵），进行花序及单花开放动态的连续观察，记录花序开放的持续时间、单花寿命、开放特点、雌雄蕊的生长状态及花粉散布情况，并对物候期进行观察.

1.2.2 花部特征及花粉、柱头形态的扫描观察

花部特征参数的测定: 盛花期，随机采集不同基株上正开放的单花30朵，分别进行花冠开口直径、花冠长、雌雄蕊长度的测定.测量工具为游标卡尺（精度0.02mm）.

花粉量、胚珠数及花粉败育率的测定：参照Cruden(1997)的方法[12]，盛花期，在标记的20个分株上随机选取30朵即将开放的花苞固定，带回室内统计各单花花粉的数量和胚珠数. 同时，另取20个即将开放的单花，进行花粉败育率的检测.

不同散粉时间柱头花粉数的测定及自动自花授粉的检测：盛花期，在50个分株上随机标记刚开放的单花150个，从开放当天开始，每天取标记单花30个，连续5d进行单花柱头花粉数统计.同时，随机选取20个刚开放没散粉的单花进行套袋，4d后，进行套袋内柱头花粉数的统计.

花粉及柱头形态的扫描观测：盛花期，在不同分株上随机选取不同时期的单花各20个，剥出花柱，立即用2%的戊二醛固定液(0.1mol/L磷酸缓冲液配置)固定，带回室内用于不同散粉时期柱头形态的扫描观察.所取材料为：1）即将开放的单花；2）开放后上边2枚雄蕊正散粉的单花；3）开放后下面2枚雄蕊散粉的单花；4）成熟的花粉粒.花粉和柱头样品的制备参照黄云兰等的方法进行[13].

1.2.3 北极花及伴生种的传粉媒介和花粉散布格局

盛花期，在北极花的实验样地随机选取样方6个（2m×3m），统计每样方内正开放的北极花以及伴生种的种类和开花数目，通过人工移栽补充伴生种的开花种类和数目，构成半人工居群6个，在晴朗天气下进行连续观测（每次30min，累计30h），分别记录北极花及伴生种的访花昆虫种类，访花行为与访花频率.在昆虫访花距离的调查中，我们设同一花序上的两朵单花的距离为0，每20cm为一个范围，通过记录访花者每次在花间访问时相邻两花间的距离，统计不同距离范围内发生的频次，分析北极花的花粉散布格局.测量距离的工具为卷尺（精度cm）.

1.2.4 花粉萌发及花粉管生长状况的荧光观察

盛花期，在不同的分株上随机标记即将开放的单花约300朵，从单花开放起，每隔8∼10h随机选取单花10∼15朵，用FAA固定液（70%乙醇-福尔马林-乙酸配置）固定，带回室内进行样品处理后，通过荧光显微镜观测不同时间段北极花的花粉萌发和花粉管生长状况.

1.2.5 结实格局

随机标记1m ×1m的北极花样方30个，分别在结实初期和后期统计每样方中有性分株顶端不挂果实、挂1个果实、2个果实的比例，计算北极花不同结实阶段的平均结实率，分析不同阶段果实形成状态及分布格局.

1.2.6 数据处理

用Excel2007 软件和SPSS 19.0 统计软件包进行数据处理与分析. 首先用One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test 进行数据的正态性检验，经检验各组数据均符合正态分布后，用One-Way ANOVA 或t检验进行花部特征中各相关参数的比较.统计数据用平均值±标准误差表示.

2 结果

2.1 开花物候与开花习性

连续3年的物候期观测显示，北极花初花期在6月底或7月初，1周左右进入盛花期，7月底或8月初进入结实期，年份间有波动.北极花的花序生于有性分枝的顶端，同一基株上的几个双悬花可同步开放.但同一花序上双悬的两单花具典型的序次开放现象，往往一朵花正在散粉或散粉后另一朵花才相继开放，两花开放间隔1∼2d.

先开放的单花，花冠口半张，柱头探出，花冠内壁具白色毛状附属物，浓密、饱满、直立，交叉成网状覆盖在雄蕊上.随着花冠开口的进一步张开，毛状附属物从花冠口开始逐渐倒伏，约3∼4h后，露出花中较高的两枚雄蕊，并开始散粉.随花冠内侧毛状附属物的继续倒伏，在上边两枚雄蕊散粉即将结束时，下面两个较矮的雄蕊也逐步暴露出来，并开始散粉.两对雄蕊散粉完毕需2∼3d，散粉后的单花持续1∼2d脱落，单花期4∼5d.花序开放时间5∼7d.

2.2 花部特征及花粉、柱头形态

2.2.1 花部特征参数的测定

北极花的花冠钟状，下垂，雌雄异位，四枚雄蕊两两序次呈现，如图2 f.每单花有花粉量2 504±120粒，胚珠10±1枚，受精后只有1个胚珠可发育成种子.对上、下两枚花药的败育率进行检测，结果显示两者无显著差异.

对不同散粉时期的柱头花粉数进行测定，结果如图1.随着开花时间的延长，柱头花粉数在逐步增高，在开放后第4∼5d时达最高，说明柱头被拜访的次数在逐步增加.其中，在单花开放的第1 ∼2d，只有上两枚雄蕊散粉时，在标记的单花中43.9%的柱头有花粉，到了第4∼5d，下两枚花药处于散粉或散过粉状态时，在标记的单花中有84.2%的柱头有花粉，平均柱头花粉数为17.93±3.09粒.自然状态下，套袋内柱头花粉数为0，说明无自动自花授粉现象.

表1 北极花花部特征参数Tab 1 Floral traits parameters of Linnaea borealis

图1 北极花不同开花时期柱头花粉数Fig 1 The No. of pollen grains on stigma in different flowering days

2.2.2 花粉及不同时期柱头形态的扫描

对北极花花粉和不同时期柱头形态的扫描观测显示：待开花苞的柱头表面形态与正散粉的柱头无显著差异，柱头乳突细胞均饱满有活力，表明在花药散粉前柱头即具有接受花粉的能力(图2 a-b).北极花的花粉粒近球形，具3个萌发孔和刺状突起的外壁纹饰(图2 c).

2.2.3 花粉萌发及花粉管的生长状态

荧光观测显示：北极花的柱头花粉均能正常萌发和进行花粉管的生长(图2 d-e).开放后8h开始有花粉萌发，随着开花时间的延长，柱头上萌发花粉的数目和有花粉的柱头数目在明显提高.其中，开放后0∼24h、25∼50h 和50∼72h，分别有17.2%、43.3% 和70%的柱头有花粉数，在72h后出现有生长到子房的花粉管.这与自然状态下所测柱头花粉数一致.所有有花粉的花柱，均处于花粉萌发或花粉管生长状态.但生长到子房顶部的花粉管数量很低，约占相同散粉时段有花粉柱头的1/3.

2.3 传粉者访花情况及传粉距离

北极花的访花昆虫有蝇、食蚜蝇、独居蜂，其中，蝇为主要的访花者，约占总拜访次数的70%.晴朗天气，10:00以后有昆虫出现，12:00∼17:30访花昆虫数量较多，为访花高峰期，19:00以后逐步减少.平均访花频率为0.102 4±0.056 7次/花/h. 访花昆虫活动受光照和气候条件影响较大，同一时间段，晴朗天气和有阳光照射的地方访花昆虫较多，而阴雨天气和遮阴的地方无访花昆虫或访花昆虫很少.

北极花与伴生种的花期不完全一致，但有重叠，且访花昆虫种类一致.通过移栽伴生种，构建半人工居群观测访花偏好及访花频率，结果表明：北极花与伴生种间有昆虫互访现象，但无明显的访花偏好.其中伴生种独丽花的花期较早，在北极花的盛花期，独丽花已到盛花末期，其访花频率为0.009 5±0.009 5次/花/h；镰状卷耳的访花频率为0.246 5±0.058 6次/花/h；伴生种的平均访花频率为：0.102 9±0.027 7次/花/h，与北极花(0.102 4±0.056 7)相比二者无显著差异(t=1.559;P=0.121).

对昆虫所访相邻两朵花的距离进行统计（图3），不同访花距离的发生频率并不相同，传粉者对花粉的传播距离主要集中在0∼20cm范围之内，发生频率达58.33%，其中在同一花序上访问的发生频率为13.33%；20∼40 cm范围内的发生频率为18.33%，随着距离的增加，发生频率在逐步降低.

图2 北极花花序、花粉，柱头的形态观察及花粉的萌发与生长Fig 2 The morphological obvision of inflorescence, pollen grains, stigma as well as the pollen germination and pollen tube growth of L. borealise

图3 北极花花粉传播距离的频率分布Fig 3 The frequency distribution of pollen migration distance

2.4 结实格局

对分布区内各样方的结实率及果实分布格局进行统计，结果如图4.在北极花的不同结实阶段，结实率及果实分布格局明显不同.结实初期，平均结实率为82.18±1.48%，该阶段为进入结实期的第10d，虽然果实存在，但果实膨大不明显，果实内的胚珠也没表现出明显的变化，挂2个果的比例最高，达59.65±2.8%，挂1个果和不挂果的比例分别为31.01±3.03%，9.33±1.67%，显著不同.到结实后期，平均结实率仅为34.85±4.18%，该阶段为进入结实期的第25d，果实膨大明显，果实内有正发育的种子.从果实的分布格局看，在结实后期，挂1个果(24.32±2.21%)和挂2个果(22.69±3.88%)的比例远低于不挂果的花序比例(52.99±4.72%).结实后期，挂1个果的比例(24.32±2.21%)与初期(31.01±3.03%)没有差异，但是挂2个果的比例(22.69±3.88%)显著低于结实初期(59.65±2.8%).

图4 北极花的结实格局及不同阶段的结实率Fig 4 The fruit-set pattern and the fruit- set rate of L.borealisein different fruiting stage

3 讨论

同株异花授粉对植物的交配系统具有重要影响，在克隆植物中表现的尤为突出.为此，有花植物表现出了多种性状以降低同株授粉的影响.但是由于传粉过程中影响因素的复杂性，使得这些性状的有效性不同[15,16].尤其在较大斑块的克隆植物内更是难以避免[17,18].在北极花中，花部特征、开花习性、游击型克隆构型及自交不亲和性等性状在降低雌雄蕊干扰、避免同株异花授粉方面具有积极作用，但是较短的传粉距离所导致的高比例的同株异花授粉现象尤为突出，并成为影响北极花有性繁殖的重要因素.

3.1 花展示及同株异花粉的生殖干扰

雌雄异熟和雌雄异位是植物常见的两种避免花内自交和降低雌雄干扰的机制[14,19]. 北极花雌蕊高8.60±0.15 mm，二强雄蕊高度分别为5.91±0.11 mm，4.12±0.07 mm，单花半开时，雌蕊已探出，并具活力，而雄蕊仍被花冠内毛状附属覆盖，随着毛状附属物逐渐倒伏，才暴露出较高的两枚雄蕊，从雌蕊探出到上两枚花药开始散粉，间隔3∼4h左右，表现出典型的雌雄异位和不完全的雌雄异熟.这为避免花内自花粉滞留和降低雌雄蕊干扰提供了保障.

在单花水平，北极花4枚雄蕊两两序次呈现，使得单花期持续4∼5 d；而在花序上，双悬的两单花具典型的序次开放现象，使得花序开放时间得到了延长，达6∼7d.对北极花不同时期花柱头花粉数的检测可以看出，从上两枚雄蕊散粉时，43.9%的柱头有花粉，到下两枚花药处于散粉或散过粉状态时，81.4%的柱头有花粉，随着散粉时间的推迟，北极花柱头花粉数和有花粉的柱头数目均在增加. 相同的例子，在由蜂鸟传粉的雌性先熟的藤本植物Bomarea acutifolia中，6枚雄蕊依次开裂，一个花序的散粉时间可持续9d[20].在缺乏传粉者或低温的高山环境，花粉的序次呈现对于提高雄性适合度以及对高山或极地等严酷环境适应性的提高均具重要意义[21−23].

然而，自然状态下北极花较低的结实率（34.85±4.18%）反映其花展示在促进异交方面并没有得到有效的发挥.北极花柱头花粉数为17.93±3.09，且只有一枚胚珠可发育成种子，较充足的柱头花粉数似乎不存在花粉限制.但是，荧光观测显示柱头上正常萌发的花粉，约有1/3能够长到子房顶部.这说明柱头上较高的花粉数显然为不亲和的同株花粉.北极花具自交不亲和性，对其进行人工异花授粉，可明显提高结实率[24].这一现象在北极花的苏格兰分布区也有发现[2,11].北极花具典型的避免花内自交，促进异花授粉的花部综合征，但并没能避免同株异花授粉的生殖干扰.

3.1.1 花传粉模式与有性生殖

影响植物花粉流传播的因素主要受传粉昆虫和开花式样的影响[25]. 蝇类在高山环境中分布较为普遍[26,27]，但具有活动能力低，访花时间短，访花路径没有规律性等特征[28−30].北极花的访花昆虫有蝇、食蚜蝇和蜂.其中，蝇为主要访花者，但访花距离非常有限，主要集中在0∼20cm范围之内，并成为北极花高比例同株异花授粉的主要原因.尽管北极花为游击型克隆构型，但居群呈明显的斑块状分布[21]，较短的访花距离限制了基株间异花粉的传递.同时，同期开花的植物–伴生种在增加传粉者吸引的同时也增大了对访花者的竞争和对花粉传递的干扰.这些因素均增加了花粉流近距离的传递.种子和果实的发育通常受资源限制或花粉来源的影响，出现受精前或受精后的败育.在北极花中，从结实格局的数据看，如果受资源限制，结实初期挂1个果的比例会较大，不挂果或挂2个果的比例会较低.但事实不是如此，结实初期挂2个果的比例最高，达59.65±2.8%，挂一个果的比例次之，不挂果的比例最低.也证明了北极花中较高的果实脱落率缘于不亲和的高比例同株异花授粉.自交不亲和降低了同株授粉的雌性代价，在基株间花粉传递充足的情况下，自交不亲和的维持是有益的. 但是如果亲和花粉限制，自交不亲和将降低种子生产，其维持代价将会很高.在北极花中，克隆生长习性、较为单一的传粉者、较短的传粉距离所导致的高比例的同株异花授粉等成为植物有性繁殖率低下的主要原因.