山西栽培秦艽有效成分的含量测定

任 蕾，孙 璠，温建英，王京康

（山西中医药大学，山西晋中030619）

秦艽是龙胆科植物秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）的干燥根，分布于我国的北方各地，按性状可分为麻花艽、秦艽和小秦艽［1］。在中国药典规定的原植物中，黄土高原及青藏高原东部是我国秦艽资源分布中心，山西等省是秦艽的主要产区。秦艽味苦、辛，性平，入肝、胆、胃经；其功效为祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热；临床用以治疗中风半身不遂、筋脉拘挛、骨节酸痛、风湿痹痛等病症［2］。现代研究表明，其祛风湿的主要有效成分是以龙胆苦苷为代表的环烯醚萜苷类化合物［3-7］。

近年来，随着秦艽药理作用的不断发现，秦艽临床使用逐渐增多，市场供应已无法满足临床需求。由于对秦艽的过度开发和利用，其野生资源已遭到严重破坏，早在1987年秦艽就被列入《国家重点保护野生药材品种名录》，目前秦艽已被列为国家三级保护药材。面对秦艽资源匮乏这个问题，寻找新的适宜栽培秦艽的地区和进行规范化的秦艽人工种植显得尤为重要。本实验采用UV法和HPLC法检测山西栽培秦艽中主要药效成分的含量，为我省栽培秦艽药材提供基础数据支持。

1 仪器与试药

1.1 实验药材

秦艽（山西静乐县刁儿沟村药材种植合作社），经山西中医药大学中药鉴定教研室王兵老师鉴定为龙胆科正品秦艽。

1.2 实验仪器

Waters高效液相色谱e2695（二极管阵列+荧光）；紫外可见分光光度计（UV-6100S，上海元析仪器有限公司）；暗箱式紫外透射仪（ZF-90型，上海顿村电光仪器厂）；精密电子天平（JA4003，上海良平仪器仪表有限公司）；数显电子恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。

1.3 实验试剂

龙胆苦苷标准品（上海融禾医药科技有限公司，批号：170119）；甲醇（色谱纯，天津市进丰化工有限公司，批号：20161216）；无水乙醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20150921）；三氯甲烷（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20161123）等。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

将秦艽药材挑选、分类，选择大小形态接近的药材洗净，阴干备用。精密称取秦艽药材粉末4.000 g于洁净的250 mL圆底烧瓶中，精密量取70%乙醇溶液160 mL。85℃下水浴回流提取80 min，过滤，补足失重，精密移取续滤液 1.0 mL于50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，备用。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取龙胆苦苷标准品0.008 1 g于洁净的10 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解定容，精密移取该溶液2.5 mL于一洁净的25 mL容量瓶中，再次定容，摇匀，静置，即得浓度为81.0 mg/L的龙胆苦苷对照品溶液。

2.3 薄层定性鉴别

展开剂为三氯甲烷∶甲醇∶水 =15∶5∶0.5，对照品溶液和供试品溶液同时点样，预饱和 10 min，展开后，取出晾干。在紫外灯254 nm下检识晾干后的薄层板，结果见图1。相同位置有相同斑点，可见供试品中有龙胆苦苷成分。

图1 薄层色谱图

2.4 UV法测定总环烯醚萜苷含量

2.4.1 标准曲线的制备 取适量的龙胆苦苷对照品溶液和供试品溶液，以70%乙醇溶液为参比，在200～500 nm波长范围内进行扫描，供试品溶液和龙胆苦苷对照品溶液在294 nm处均有最大吸收。

分别吸取对照品溶液 3 mL、3.5 mL、4.5 mL、6.0 mL、6.5 mL 于 10 mL 容量瓶中，用 70% 乙醇溶液定容，以70%乙醇溶液作为参比，在294 nm处检测吸光度，以龙胆苦苷对照品溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，拟合得到标准曲线，其线性回归方程为：y=0.014 9x+0.001 3，x为龙胆苦苷对照品溶液浓度（单位：mg/L，x范围：24.3～52.65 mg/L），y为吸光度值，R2=0.999 7。结果见图2。

图2 龙胆苦苷紫外色谱标准曲线图

2.4.2 精密度试验 取浓度为24.3 mg/L的龙胆苦苷对照品溶液，用70%乙醇溶液为参比，在294 nm波长处连续测定5次吸光度，计算RSD值为0.59%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 将秦艽药液分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h于 294 nm 波长处定点检测其吸光度值，计算RSD值为0.84%，表明供试品12 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取粉碎好的秦艽药材 6份，按2.1项下制备供试品溶液，在294 nm处测定吸光度值，计算RSD值为 1.64%，表明该实验所采用的实验方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 分别于 5份按2.1项下制备的供试品溶液中，精密移取龙胆苦苷对照品溶液，加入样品中（移取的标准品的量以梯度递增），在294 nm处测定其吸光度值，计算回收率，平均回收率为98.25%，RSD值为0.98%。结果见表1。

表1 紫外加样回收率（UV法）

2.4.6 总环烯醚萜苷含量测定 精密量取按2.1项下制备的供试品溶液1 mL，置5 mL容量瓶中，定容，摇匀，即得。在294 nm处测定吸光度，计算供试品中总环烯醚萜苷含量，平均含量为9.857%。结果见表2。

2.5 HPLC法测定龙胆苦苷含量

2.5.1 色谱条件 色谱分离和检测条件为：色谱柱：VenusilXBP C18（A）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.04% 醋酸∶甲醇（65∶35）；流速：1.0 mL/min；检测波长 271 nm；柱温：26℃；进样量：10 μL（自动进样）。

表2 UV法测定环烯醚萜类总苷含量的检测结果

2.5.2 标准曲线的制备 精密移取对照品溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL 至 10 mL容量瓶中，用甲醇定容。在上述色谱条件下依次进样检测，每次进样10 μL，记录各个浓度的对照品的色谱图及峰面积。以标准品浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标，制作标准曲线并拟合线性回归方程。线性回归方程为：y=0.103 1x-0.070 3，R2=0.999 7，表明龙胆苦苷检测浓度在 4.3～18.76 mg/L范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5.3 精密度试验 取同一批供试品溶液，按照2.5.1项下色谱条件，连续进样 6次，通过计算各色谱峰的相对保留时间RSD值为1.07%，表明仪器的精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一批供试品溶液，按照2.5.1 项下色谱条件，分别在 0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h进样，各色谱峰的相对保留时间RSD值为1.44%，表明供试品溶液24 h内稳定性较好。

2.5.5 重复性试验 取同一批样品，精密称定，按照2.1项下方法制备供试品溶液进样，各色谱峰的相对保留时间RSD值为1.66%，表明该方法的重复性较好。

2.5.6 加样回收率实验 分别精密量取0.5 mL浓度为 6.4 mg/L、12.8 mg/L、19.20 mg/L 的标准溶液，再取秦艽提取液0.5 mL，在选好色谱条件下依次进样测定，每次10 μL，测量并计算加样回收率，平均回收率为 99.75%，RSD值为 0.01%。

2.5.7 供试品中龙胆苦苷含量测定 精密量取按2.1项下制备的供试品溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，甲醇定容。扫描得龙胆苦苷对照品溶液色谱图与供试品溶液色谱图，在271 nm处龙胆苦苷对照品和供试品溶液保留时间、峰形相似，因此选择271 nm为检测波长。标准品与供试品溶液的色谱图见图3，图4，计算所得供试品中龙胆苦苷含量为 8.580%。

图3 对照品溶液色谱图

图4 供试品溶液色谱图

3 讨论

本实验用龙胆苦苷标准品为对照，采用UV法测定秦艽中环烯醚萜苷类化合物的含量，HPLC法测定秦艽中龙胆苦苷的含量，分别为9.857%和8.580%。两种方法专属性高，具有较高的可操作性和可靠性，可以应用于秦艽药材的质量控制。《中国药典》2015版规定秦艽中龙胆苦苷含量不得少于2.5%，本实验研究表明，山西栽培秦艽质量高于药典要求，说明在我省推广秦艽药材的种植栽培是可行的。

通过对UV法和HPLC法的比较，发现UV法测得的含量要比HPLC法测得的含量高，其原因是UV法不经分离直接检测，所测得的是具有相同发色团的总含量，并非单一成分的含量。所以UV法具有测定速度快、操作简单、成本低等优点，测得的是秦艽中环烯醚萜总苷的含量。而HPLC法是一种分离分析方法，将各组分在色谱柱内进行分离后再分析，排除了龙胆苦苷类似物的干扰，所测得的结果一般是单一成分的含量，所以UV法测定结果要高于HPLC法。本实验中HPLC法的精密度、稳定性、加样回收率都较好，对秦艽中龙胆苦苷含量的分析比较准确。