翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌体外抑菌活性及小鼠感染模型的防治效果研究

高 艳，郝宝成，吴金措姆，格桑卓嘎，拉巴次旦，班 旦，四郎玉珍，邢小勇，梁 云，杨志伟，胡永浩* ，梁剑平*

(1.甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州730050;3.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨850009;4.兰州市肺科医院，甘肃兰州730046)

牛出血性败血症，简称“牛出败”，是由多杀性巴氏杆菌引起的牛急性热性败血性传染病［1］，该病原是条件致病菌，机体抵抗力降低时病菌即可侵入体内大量繁殖［2］，除内源性感染发病外，也经呼吸道，消化道以及损伤皮肤和粘膜感染。易感动物为牛［3］，猪［4］等动物，发病死亡率高达 80%以上，痊愈牛虽可产生免疫力，但其生产性能出现一定幅度下降［5］。西藏牧区内，牛出败常地方流行或零星散发，根据临诊症状，分为肺炎型、浮肿型和败血型［6］，此病潜伏期为 2～5 d，多见犊牛［7］，发病牛多呈急性经过，死亡率高达40%～50%［8］，如芒康县，林芝地区［9－10］等。近年来，西藏、青海［11］等主要牧区发病呈现上升态势，不仅带来巨大的经济损失，且对草场和水源造成二次污染。

近年来，抗生素滥用导致临床分离到的牛源多杀性巴氏杆菌耐药菌株不断增多，临床抗感染治疗效果越来越差，新疫苗研制开发周期较长，这些因素严重影响了对牛出血性败血症的临床预防治疗。有研究表明中药或天然植物提取物可发挥对病原菌直接杀灭作用而不产生耐药性或提高其对抗生素的敏感性［12－15］，如中药“连黄”可降低巴氏杆菌的耐药性［16］。利用中药或天然植物提取物用于临床疾病防治已逐渐成为研究热点。藏药因其生长环境得天独厚，药用成分含量高，药性纯正副作用低，临床治疗效果较好，已得到很多研究者的认可［17］。试验利用该复方对引起牛出败的多杀性巴氏杆菌进行体外抑菌活性研究及体内防治实验，以期为临床治疗提供参考依据。

1 材料

1.1 药材与菌种 铁棒锤、诃子、藏木香、安息香、翼首草、兔耳草、草果、红景天，均购自西藏亚郎藏药材销售有限公司。

多杀性巴氏杆菌(编号:CVCC1659)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 培养基 MH琼脂培养基(Mueller－Hinton Agar，MHA)，MH 肉汤培养基 (Mueller－Hinton borth，MHB)均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;LS4509增菌培养基，批号ZBAP－170716D，购自广州市迪景微生物科技有限公司。

1.3 实验动物 SPF级昆明(KM)小鼠共计240只，雌雄各半，体重(18±2)g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，批号为SCXK(甘)2015－0001，连续饲喂 7d，自由采食，饮水，观察小鼠适应环境情况。

1.4 仪器和试剂 生物安全柜(HFsafe－1500，上海力申科学仪器有限公司);Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);恒温培养振荡器(HNYC－202T，天津欧诺仪器股份有限公司;VITEK 2 COMPACT仪器(梅里埃生物公司);沃特浦制水机(四川沃特尔水处理有限公司);CO2培养箱(TABAI ESPEC CORD，Japan);革兰氏阴性细菌鉴定卡(产品批号2410112103，梅里埃诊断产品(上海)有限公司);注射用硫酸链霉素(产品批号:170103，合肥强力动物药品有限责任公司);注射用青霉素钠(产品批号:16050905－1，哈药集团);红景天苷对照品(购自于中国食品药品检定研究院，含量以 98.8%计，批号为 110818－201708);甲醇(色谱纯)。

2 方法

2.1 翼草景香水煎液的制备 准确称取各组分药材，加10倍体积超纯水水浸泡2 h，大火煮沸后连续煎煮2 h，四层纱布过滤，收集滤液，药渣中再加入8倍体积超纯水，大火煮沸后连续煎煮2 h，加四层纱布过滤，合并两次滤液，烘干备用。

取9支10 mL无菌离心管，用二倍稀释法将药液分别稀释为生药浓度为 500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.8，3.91，1.95 mg/mL，标记为 2－1 ～ 2－9，4℃保存，以备牛津杯法中使用。

2.2 HPLC测定翼草景香中红景天苷方法

2.2.1 色谱条件 kromasil－sb－c18 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇:水=15 ∶85，柱温为30℃，检测波长275 nm，流速1 mL/min，进样量10μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取红景天苷对照品，溶于50%甲醇，配制成浓度为0.5615 g/L的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 称取复方提取物4.00098 g，置具塞锥形瓶中，加入10 mL甲醇，超声处理30 min，离心取上清，重复一次，合并两次上清于25 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，再将其转移到50 mL容量瓶，用水定容至刻度，经 0.22μm滤膜过滤后备用。

2.2.4 标准曲线 将红景天苷对照品分别稀释为0.56150000、0.28075000、0.14037500、0.07018750、0.03509375 g/L的工作标准液，经 0.22 μm 滤膜过滤后待进样。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，求其回归方程及相关系数。

2.2.5 精密度试验 取浓度为0.14037500 g/L的工作标准液重复进样6次，测定其峰面积的RSD。

2.2.6 稳定性试验 取一供试品溶液分别于 0，2，4，8，12，24 h 进样，测定其峰面积的 RSD，考察样品的稳定性。

2.2.7 重复性试验 取同一批次样品六份，按2.2.3制备供试液，按色谱条件进样，计算样品含量，峰面积RSD值。

2.2.8 加样回收率试验 取已知浓度的样品1 mL，分别在其中加入不同体积的工作标准液(浓度为0.56150000 g/L)1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mL，按色谱条件计算供试样液回收率及RSD值。

2.3 菌悬液的计数和制备 将原菌液进行7次10倍稀释，吸取100μL稀释液于MHA平皿涂布均匀，重复3次，37℃恒温培养箱中培养18 h，对菌落进行计数，求平均值，将菌液稀释为1×106CFU/mL，现用现配。

2.4 牛津杯法测定翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌抑菌作用 按向双云等［18］做牛津杯的方法进行试验，对照组为无菌水，每个药液浓度重复3次，4℃冰箱放置2h，37℃恒温培养18 h，测量抑菌圈直径，取平均值。

2.5 翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌的MIC值根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)制定的微生物临床检验标准，取12支试管，依次标记为1～12，按向双云等［18］利用试管2倍稀释法测定MIC值，试管1～10生药浓度依次为 250，125，62.5，31.25，15.63，7.8，3.91，1.95，0.98，0.49 mg/mL。试管 11 为阴性对照，12为空白对照，37℃摇床培养18 h，将培养物接种于MHA培养基，平板标记为2－1～2－11，37℃恒温培养18 h，并设3个重复平行组。

2.6 小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌模型的建立将SPF级昆明小鼠132只，随机分11组，A～K组每组12只，雌雄各半。将原菌液10倍稀释为108～102CFU/mL，A－G组依次腹腔注射菌液浓度为1×108～1×102CFU/mL 100 μL，H 组腹腔注射浓度 1×102CFU/mL菌液50μL，连续观察3 d。并将菌液浓度为1×102CFU/mL 50μL进行3次重复，统计小鼠死亡率。

试验结束后，将存活小鼠处死并解剖，观察病理变化，并取一部分小鼠肺脏组织做细菌涂片染色，镜检。同时将病料接种于MHA培养基中，划线挑取单个菌落，将其配制为0.50－0.63麦氏浓度的菌悬液，利用全自动微生物鉴定及药敏系统(VTEK 2 COMPACT)进行细菌鉴定。

2.7 翼草景香水煎液对小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌防治作用 将SPF级昆明小鼠108只，雌雄各半，随机分为9组，分别为预防组1～3、治疗组1～3、阳性对照组、阴性对照组、空白对照组。预防组1～3分别连续 5 d 灌服 0.1、0.3、0.5 mL 生药浓度为125 g/L藏药复方水煎液，在第5 d给药后1 h，每只小鼠腹腔注射50μL多杀性巴氏杆菌菌液;治疗组每只小鼠腹腔注射50μL多杀性巴氏杆菌菌液，感染 1 h 后，分别灌服 0.1、0.3、0.5 mL 生药浓度为125 g/L藏药复方水煎液1次;阳性对照组感染多杀性巴氏杆菌1 h后按每千克体重肌肉注射2万单位青链霉素混合药液治疗1次;阴性对照组在感染细菌1 h后，灌服0.5 mL无菌水1次;空白组灌服0.5 mL无菌水1次，正常采食，饮水。将各试验组小鼠饲喂于相同环境中，观察统计3 d内小鼠精神状况及死亡情况。

3 结果与分析

3.1 HPLC法测定翼草景香红景天苷含量结果

3.1.1 标准曲线 按色谱条件进样求出其回归方程为 y=3281.6x+3.965，r2=0.9999，红景天苷进样量在 0.03509375～0.56150000 g/L 之间峰面积与进样量呈良好线性关系，见图1。

图1 红景天苷的标准曲线Fig 1 The standard curve of salidroside

3.1.2 精密度试验 取浓度为 0.14037500 g/L的工作标准液重复进样 6次，其平均峰面积为927.1369833，RSD=0.17%，表明仪器的精密度良好。

3.1.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于配制后 0，2，4，8，12，24 h 进行测定，供试品溶液 RSD值在0～8 h内为1.82%，0～24 h内为13.30%，故样品在8 h内基本稳定，这时其峰面积为730.49461，供试品浓度为0.2214 g/L，则翼草景香水煎液中红景天苷含量为 2019.78 mg。

3.1.4 重复性试验 取同一批次样品六份，按色谱条件进样，其平均峰面积为 732.8506267，RSD=2.65%，表明样品重复性良好。

3.1.5 加样回收率试验 由表1可知，红景天苷的平均回收率为90.99%，RSD为4.35%。

3.1.6 复方浓度对应关系 结果见表2。

表1 加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery rate test

表2 复方生药浓度与以红景天苷标定复方浓度关系Tab 2 The relationship between the concentration of compound crude drug and Salidroside

3.2 牛津杯法测定翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌抑菌作用 翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌抑菌圈大小随生药浓度变化见图2。当翼草景香水煎液浓度为0.49263 g/L时，对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈平均直径为28.5 mm，当翼草景香水煎液浓度大于等于0.00385 g/L时对多杀性巴氏杆菌有抑菌效果。

图2 抑菌圈直径大小随药物浓度的变化Fig 2 The diameter of bacteriostatic circle varies with the drug concentration

3.3 翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌的MIC值测定 结合图2、表2及表3，翼草景香水煎液浓度大于0.00385 g/L时，培养皿中无细菌生长，小于0.00385 g/L时培养皿中均有细菌生长。因此，翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌的MIC值为0.00385 g/L。且由表3可看出，其最小杀菌浓度也是 0.00385 g/L。

表3 不同药物浓度下的菌落生长数目Tab 3 The number of colonies at different drug concentrations

3.4 小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌模型的建立感染多杀性巴氏杆菌后，小鼠出现精神沉郁，被毛逆立，食欲下降。感染试验结束后各组试验小鼠死亡统计情况如表4。小鼠剖检可见肺脏有明显点状淤血、坏死，心脏血管明显充血，肝脏上有散在的白色坏死点，肠道有鼓气现象，取肺部组织做细菌涂片，革兰氏染色菌体为紫红色(图3)，初步鉴定为革兰氏阴性菌;利用全自动微生物鉴定及药敏系统(VTEK 2 COMPACT)进行鉴定，结果表明，分离鉴定获得细菌为多杀性巴氏杆菌的可信性为97%。并将菌液浓度为1×102CFU/mL 50μL注射感染小鼠，经3次重复平行试验，SPF级昆明(KM)小鼠腹腔注射死亡率均为75%，表明致死率为75%的小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌模型的建立成功。

表4 小鼠感染不同浓度菌液的死亡率Tab 4 Mortality in mice infected with different concentrations of bacteria

3.5 翼草景香水煎液对小鼠体内感染多杀性巴氏杆菌防治作用 预防组不同剂量小鼠死亡率为50%，41.7%，81.8%，治疗组小鼠死亡率为 66.7%，50%，75%，阴性对照组小鼠死亡率为75%，阳性和空白对照组死亡率为0。如图4所示，该翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌有一定防治作用，当给予每只小鼠含红景天苷0.0369mg的复方时，具有显著的预防作用，能明显降低死亡率33%。

4 讨论与结论

4.1 翼草景香组方 藏医经典著作《四续》及《四部医典》均详细的记载了“对治”是藏药治疗疾病的基本原则，是药味、性、效配方的理论依据。藏药方剂组方主要遵循“主仆原则”，具体组方时又有君王、大臣、王妃、士兵药的不同，与中药的“君臣佐使”有所不同，藏医多以药效强弱来区别“君王、大臣”。藏医组方时，对疾病的诊断需准确，明确疾病属性和药性之间的关系，藏药药性理论与中医不同［19］，见表 5。

牛出血性败血症在中医辩证上属于疫疠之病，临床上常以败血为主要症状，属于热性病。藏医上，该病是因为赤巴紊乱造成的热性疾病，根据“对治”原则，治疗该病应该选用具有寒、凉性质的药物。翼草景香复方有八味药组成，分别为翼首草，兔耳草，诃子，红景天，安息香，草果，铁棒锤，藏木香，在西藏牧区已用于牛出血性败血症临床防治。其组方中翼首草含量最多，属苦、寒药物，是翼草景香复方的主药，其水提物具有很好的抑菌效果［20］;《四部医典》将兔耳草列为草药类之首，味苦性寒，藏医中兔耳草，诃子也多用于治疗赤巴病［21－22］，此两味药含量虽少于翼首草，亦是翼草景香复方的主药，铁棒锤亦属苦、寒药物，虽具有毒性，但与诃子配伍使用能有效降低其毒性［23］。翼草景香复方使用翼首草，兔耳草，诃子清热解毒，结合安息香，藏木香，草果等缓解症状，利用红景天提高机体免疫力，组方组成符合疾病“对治”原则，遵循“主仆”原则，且试验结果表明，翼草景香水煎液对牛出血性败血症致具有防治作用。

图3 菌体革兰氏染色结果(1000×)Fig 3 Cell Gram stain results

图4 小鼠死亡率随复方剂量的变化Fig 4 mice mortality varies with the compound dose

表5 藏医五元、六味、八性、十七效与疾病对治简表

4.2 高效液相色谱法测定翼草景香水煎液中红景天苷含量 超高效液相色谱凭借其选择性高，分离效果好，检测灵敏度高等优点被运用于多个领域中，如化学分析，环境分析，药物分析，食品分析［24］等，药材的化学成分含量测定方法有薄层色谱法、气相色谱法、高效毛细管电泳法、HPLC［25］等。

红景天是复方主要药材之一，红景天苷作为红景天的主要成分，其不具备抑菌作用，但可提高机体免疫力。因此，本文利用HPLC测定翼草景香水煎液中红景天苷的浓度，并以此来标定该翼草景香水煎液浓度。利用100%甲醇溶解红景天苷标品时，出现两个相连的峰，经液相全波长扫描及分光光度计全波长扫描，确定其为一种物质，经试验，利用50%甲醇溶解对照品时其峰形最对称。在该色谱条件下，标准曲线、仪器精密度、样品稳定性及重复性RSD值都良好，加样回收率为90.99%，偏低，RSD值为4.35%，偏高，可能是由于该溶液为复方提取物，成分众多，不同浓度下，中药成分发生的相互作用程度不一。

4.3 翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌体外抑菌作用 研究中利用牛津杯法和试管二倍稀释法测定翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌的体外抑菌活性，当翼草景香水煎液浓度为0.49263 g/L时抑菌圈平均直径为28.5 mm，表明翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌高度敏感，且其MIC值为0.00385 g/L，比吕彪、曲径等［26－27］研究的单味中草药抑菌效果更显著。

4.4 翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌感染模型小鼠治疗效果 实验动物疾病模型已被广泛应用于医学生物学的研究领域中，本文通过成功建立多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型，研究了翼草景香水煎液对巴氏杆菌的体内防治作用，经观察，小鼠感染巴氏杆菌后，20 h后无死亡情况，故治疗及对照组均给药1次，预防及治疗的高剂量组0.5 mL反而出现治疗组死亡率较高现象，可能由于感染细菌后小鼠的免疫力降低所致，当给予0.3 mL复方水煎液时，预防组降低死亡率33%，治疗组降低死亡率25%。

目前，国内外对于牛出败多采用疫苗预防［28－29］，但由于多杀性巴氏杆菌的荚膜型和血清型众多，疫苗免疫具有特异性不能全面覆盖［30］，或基层兽防人员缺乏技术培训采取不正确的接种方式，接种剂量［31－32］等，牛出败依旧每年发生，临床上治疗巴氏杆菌病多采用抗生素类药物，多连续用药3 d，长时间使用效果降低，中药多作为后期护理使用或不用，使用藏药复方防治更是未找到相关报道。因此，本文复方以翼首草作为主药，其可入血成分有

绿原酸、獐牙菜苷等，有文献报道绿原酸具有抑菌作用［33］，但在此复方是否为主要有效成分尚需进一步研究确定;红景天与诃子中都含有没食子酸，具有抗菌作用［34－35］。文中翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌感染小鼠具有明显的防治作用，且预防作用强于治疗作用。

4.5 结论 翼草景香为藏药复方，在西藏部分牧区已用于牛出血性败血症临床防治，本文通过液相定量复方中红景天苷浓度为0.2214 g/L，体外及体内试验证明翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌具有良好的体内、外抑菌活性，且其预防作用较治疗作用明显，这为牛出血性败血症的临床药物防治提供新的选择。