胎牛血清不同组分对昆虫杆状病毒复制的影响

李长路

(广州蕊特生物科技有限公司，广州510000)

目前，在动物疫苗生产中，为了降低生产成本，减少生物制品纯化损失，减少由于不确定蛋白或血清组分带来干扰或差异的风险，提高生物制品的安全性，大多数采用无血清培养基［1－2］。但在使用过程中，有些病毒，如口蹄疫病毒有时会出现细胞生长良好，但病毒产量不高的问题。为了克服这一问题，许多厂家在病毒生产过程中，还是要加入1%～3%的低浓度血清。为了研究胎牛血清中的哪些组分对病毒复制起促进作用，我们采用亲和凝胶层析方法分离出四个血清组分，分别配制成培养基，培养SF9细胞，接种昆虫杆状病毒，进行空斑测定病毒滴度、流式检测等实验［3］。如果能把血清中不同组分对病毒复制的影响分析清楚，即哪些组分对病毒复制起促进作用，哪些组分起抑制作用，从而在疫苗生产中，加入对病毒复制起促进作用的血清组分，去除那些对病毒复制有抑制作用的组分，可以有效提高疫苗产量。目前，提高病毒复制的方法主要集中在细胞驯化和病毒自身改造，血清中不同组分对病毒复制的影响，还未有报道。本实验从胎牛血清中分离出五个混合组分，培养昆虫杆状病毒，观察不同组分对病毒复制效率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清FBS:广州蕊特生物科技有限公司，批号 20180318;胎牛血清样本 S1、S2、S3、S4:用welchrom 4B填料，分别从上述同一批号胎牛血清FBS中分离获得的混合组分，广州蕊特生物科技有限公司提供;培养基:Grace＇s培养液，批号20150709;细胞:ATCCSF－9，批号 20180810，代次41;病毒:BAC－GFP V6，滴度 1.08×107PFU/mL，由广东华南疫苗股份有限公司提供;流式细胞仪:C6、BD Bioscience。

1.2 方法 在6孔板上接种SF9细胞，培养24 h，接种 0.01MOI的 BAC－GFP 病毒;按照 0、0.3%、0.6%、1.3%、2.5%、5%的 FBS 组分的浓度梯度加入6孔板中进行病毒培养，原胎牛血清FBS做对照;分别在 24 h、48 h、72 h、96 h 进行荧光拍照(40×)，观察病毒复制情况;96 h收集病毒上清，进行空斑形成实验测定病毒滴度(稀释度=10－4)，收集的病毒感染SF9细胞，72 h流式细胞术检测病毒的复制情况。

2 实验结果

2.1 空斑实验观察病毒复制结果 通过空斑测定实验发现，与FBS对比，S1样本浓度在1.3%以上时，空斑数显著增加。S2样本的空斑数没有增加，反而降低。S3样本浓度在2.5%以上时，空斑数显著增加，没有S1显著。S4样本的空斑数变化无显著差异。结果见表1、图1－图5。

表1 不同浓度血清样本的空斑数Tab 1 Plaque assay of different concentration

2.2 荧光强度观察病毒复制结果 通过肉眼观察荧光强度发现，与FBS对比，S1样本随着浓度升高，荧光强度显著增强。S2样本的荧光强度没有增加。S3样本浓度在2.5%以上时，荧光强度显著增强。S4样本的荧光强度没有明显变化。结果见图 6－图 10。

图1 空斑数比较图(0.3%)Fig 1 BAC Plaque(0.3%)

图2 空斑数比较图(0.6%)Fig 2 BAC Plaque(0.6%)

图3 空斑数比较图(1.3%)Fig 3 BAC Plaque(1.3%)

图4 空斑数比较图(2.5%)Fig 4 BAC Plaque(2.5%)

图5 空斑数比较图(5%)Fig 5 BAC Plaque(5%)

2.3 流式细胞术检测结果病毒复制结果 通过流式细胞术检测发现，与FBS对比，S1样本浓度在1.3%以上时，病毒数量显著增多。S2样本的病毒数量没有显著增加。S3样本浓度在2.5%以上时，荧光强度显著增多。上述实验证实S4对病毒复制没有明显促进作用，故没有进行流式检测。结果见图 11－图 13。

3 讨论

昆虫杆状病毒是一种共价闭合环状双链DNA病毒，其特有的Bac－to－Bac表达系统具有翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的功能。本文选择病毒培养96 h，滴度达到最大值，可以收集病毒上清，感染细胞后，72 h病毒滴度达到最大值，进行流式细胞术检测。

图6 添加血清或组分浓度为0.3%，培养病毒96 h的荧光强度Fig 6 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 0.3%，at 96 h

图7 添加血清或组分浓度为0.6%，培养病毒96 h的荧光强度Fig 7 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 0.6%，at 96 h

图8 添加血清或组分浓度为1.3%，培养病毒96 h的荧光强度Fig 8 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 1.3%，at 96 h

图9 添加血清或组分浓度为2.5%，培养病毒96 h的荧光强度Fig 9 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 2.5%，at 96 h

图10 添加血清或组分浓度为5%，培养病毒96h的荧光强度Fig 10 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 5%，at 96 h

图11 S1的流式检测Fig 11 The FC of S1

图12 S2的流式检测Fig 12 The FC of S2

图13 S3的流式检测Fig 13 The FC of S3

综合蚀斑实验、荧光拍照以及流式检测结果，血清样本 S1、S2、S3、S4中，S1与 S3对BAC增殖的促进作用最为明显，而S2对BAC增殖存在抑制，S4存在微弱的促进效果。结果表明，血清中的有些组分对病毒复制起促进作用，有些组分反而抑制病毒复制。在病毒培养过程中，添加S1组分，同时去除血清中的S2组分，可以有效提高病毒复制效率，提高病毒产量，这对疫苗生产有帮助。

在生物制品中，使用无血清培养基，可提高生物制品的质量、纯度，方便产物的分离纯化，减少由血清带来的污染机会，减少过敏原，同时也减少了成本，也便于在生物反应器中进行代谢流分析，实现在线监控，精准投料。对于生产抗体用的CHO细胞、vero 细胞和杂交瘤细胞，确实有优势［4－5］。但是对于多数病毒性疫苗来说，会出现病毒产量低的情况。

对于如何在减少或不用血清的情况下，细胞生长良好，病毒产量高，是目前研究的热点，主要集中在对细胞进行驯化和对病毒自身进行改造两方面。通过对贴壁细胞进行低血清或无血清驯化，获得可以稳定传代的悬浮细胞，用于细胞反应罐生产。田波等［6］对BHK21细胞悬浮驯化，筛选出驯化的参数条件。张良艳等［7］对MDCK细胞进行驯化，用于流感病毒发酵罐培养。通过对病毒的启动子进行改造，提高病毒复制能力。刘言等［8］用HBV病毒启动子内的基因片段替换土拨鼠肝炎病毒的同源序列，来提高病毒复制能力。袁天罡［9］把口蹄疫病毒的2C蛋白的T135I突变，从而提高O/YS/CHA/05的复制。魏南南、徐守兴等［10］利用分子生物学技术研究了内源性TPL2基因对口蹄疫病毒复制的影响，发现FMDV感染BHK－21细胞后，TPL2转录水平显著上调;过表达TPL2能够促进FMDV在BHK－21细胞中复制，而下调表达内源性TPL2后FMDV的复制受到抑制，表明TPL2促进FMDV在BHK－21细胞中进行复制。谢佳汛［11］使用p53特异性抑制剂PFTɑ提前处理PK－15细胞，抑制p53的表达，然后用PRV分别感染p53抑制表达细胞与对照细胞，收集不同时间点细胞培养物，检测PRVgB基因和PRV滴度，结果表明p53抑制表达细胞内的PRVgB基因及病毒TCID50均显著低于对照组，说明抑制p53的表达对PRV在细胞内的复制具有抑制作用。王涛［12］通过实验证实，COPⅡ蛋白复合体促进CSFV复制的过程，COPⅡ介导的蛋白运输途径促进CSFV的组装或释放，为进一步探索COPⅡ在CSFV复制中的作用奠定了基础，为全面了解CSFV复制机制和生命周期提供了新的科学依据。本文研究从胎牛血清中分离不同组分对病毒复制的影响，初步证实分离出的组分S1对昆虫杆状病毒复制有明显的促进作用。至于该组分是否对其它病毒复制有同等的促进作用，后续会进一步去验证。