1株藏猪源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其生物学特性

贡嘎，王一飞，格桑卓玛，索朗斯珠，尼玛央宗，拉巴次仁

（1.西藏农牧学院动物科学学院，西藏 林芝860000；2.西藏自治区动物疫病预防控制中心，拉萨850000）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）系巴氏 杆菌科（Pasteurellaceae）巴氏杆菌属（Pasteurella）菌株，是一种常见的革兰氏阴性菌，能够感染人和多种动物的呼吸系统[1-3]而导致疾病，也是养猪业中常见的呼吸道传染病之一。

目前，虽然多杀性巴氏杆菌的致病机制尚未完全研究清楚，但荚膜、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、外膜蛋白及毒素等在该菌致病过程中的作用已逐渐被证实[4-8]。多杀性巴氏杆菌荚膜血清抗原可分为A、B、D、E 和F 等5 个血清型[9]，在猪群中以A 型、B 型和D 型为主[10]，且其血清型与致病性之间有着一定的相关性。如：A型主要引起猪的肺炎，是最常见的血清型；B型主要引起猪的出血性败血症；D型主要引起猪的萎缩性鼻炎[11]。脂多糖是革兰氏阴性菌外膜的组成成分，也是致病菌重要的毒力因子，在多数革兰氏阴性菌感染过程中所必需。多杀性巴氏杆菌的LPS基因型有8种（L1～L8），其中L3和L6型是目前在我国猪群中流行的主要基因型，且以L6型为主。

藏猪是西藏高原生态环境中特有的高原型原始猪种。藏猪养殖业是西藏地区主要的经济支柱产业之一，但是目前仍以传统的放牧饲养为主。国内外至今鲜有关于藏猪多杀性巴氏杆菌的相关研究报道，且其流行情况尚不清楚。本实验对无菌采集的病死藏猪的内脏进行多杀性巴氏杆菌分离鉴定，得到1株D型多杀性巴氏杆菌，并对其毒力基因分布情况进行检测，旨在为西藏藏猪巴氏杆菌的进一步研究奠定理论基础。

1.1 病料

从西藏某藏猪养殖基地无菌采集病死猪肺、扁桃体组织各30 份，共60 份。采用常规细菌分离法分离并进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）鉴定。

1.2 主要试剂和仪器

血琼脂平板购自杭州微生物试剂有限公司；TaqDNA 聚合酶、GreenTaqMix、PCR 试剂、核酸染料Gel View、克隆载体pMD18-T 等购自日本TaKaRa公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、Luria-Bertani（LB）培养基等购自生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR 仪、凝胶成像系统、CX22LED 显微镜等均由西藏农牧学院预防兽医实验室提供。

1.3 细菌分离培养

将采集的60 份病死藏猪的组织样品分别接种于血琼脂平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，选择单菌落进行染色镜检，然后纯化培养。

1.4 细菌鉴定及荚膜血清型分型

细菌及荚膜血清型鉴定所用引物参照文献[12-13]，引物序列见表1。PCR 扩增体系（20 μL）：GreenTaqMix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；最后，72 ℃延伸10 min。取6 μL PCR 产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

表1 多杀性巴氏杆菌鉴定及荚膜血清PCR 分型中的寡核苷酸序列Table 1 Sequences of the oligonucleotides used in P. multocida multiplex capsular serum PCR typing assay

1.5 细菌总DNA 的提取

取分离菌液1.5 mL 于离心管中，以1×104r/min离心1 min 后，向菌体沉淀中加入200 μL 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，然后向管中加入20 μL蛋白酶K溶液，混匀；接着加入220 μL缓冲液GB，振荡15 s，70 ℃放置10 min 后，溶液变得清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；再加入220 μL无水乙醇，充分振荡15 s，混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中（吸附柱放入吸附管中），以1.2×104r/min 离心30 s 后，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；接着向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD，以1.2×104r/min离心30 s后，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；再向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，以1.2×104r/min离心1 min后，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中，重复前一操作步骤；将吸附柱CB3放回收集管中，以1.2×104r/min离心2 min后，倒掉废液，将吸附柱CB3于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；最后将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μL洗脱液和缓冲液TE，室温放置2 min后，以1.2×104r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中，从而得到细菌总DNA。

1.6 毒力基因检测

用于毒力基因检测的引物参照文献[13]，引物序列及退火温度见附表1（http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.02.013）。PCR 扩增体系（20 μL）：GreenTaqMix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，退火（退火温度见附表1）1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后，72 ℃延伸10 min。取6 μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

1.7 16S rRNA 序列分析与系统进化树构建

将测序所得序列用NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Blast检索工具进行同源性分析，使用Clustal W 软件与GenBank 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中所收录的序列进行多次比对，并通过MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.8 耐药性检测

选择4 类11 种常用抗菌药物药敏纸片进行药物敏感试验。根据抑菌圈大小判定为耐药、中介或敏感。判定标准见表2。

表2 药敏试验判定标准Table 2 Criterion of antibiotics sensitivity tests

2 结果与分析

2.1 细菌的分离鉴定及荚膜血清的分型

从病死藏猪肺中分离获得1 株菌，该菌株在血琼脂平板上长出半透明露珠状菌落（图1），在显微镜下经革兰氏染色呈红色短杆菌，经亚甲蓝染色呈典型两极着色的短杆菌。细菌染色及菌落培养特性均符合多杀性巴氏杆菌特征。提取该菌株的总DNA，利用多杀性巴氏杆菌特异性引物对目的基因进行扩增。电泳结果显示，其PCR扩增产物大小在460 bp 左右（图2），与预期片段大小相符。对基因测序结果进行Blast序列分析，确定该菌株为多杀性巴氏杆菌。利用5对多杀性巴氏杆菌荚膜血清分型引物对目的基因进行PCR扩增，并对PCR产物进行凝胶电泳检测。结果显示，PCR 扩增产物大小在657 bp 左右（图2），与荚膜血清D 型引物设计扩增片段大小相符，而其他4 种血清型引物均未扩增出目的基因条带。由此确定该菌株为荚膜血清D 型多杀性巴氏杆菌。

图1 多杀性巴氏杆菌的菌落形态Fig.1 Colony morphology of P.multocida

2.2 毒力基因的检测分析

提取细菌总DNA，通过PCR对23个毒力基因进行检测。结果（图3）表明，该菌株中含有ptfA、fimA、hsf-1、hsf-2、sodA、sodC、ompA、ompH、oma87、plpB、exbB、exbD、tonB、hgbA、hgbB和Fur等16种毒力基因。

2.3 16S rRNA 系统进化树分析

16S rRNA 扩增片段经测序后用MEGA 7.0 软件构建系统进化树。结果（图4）显示，所有多杀性巴氏杆菌菌株形成2个主要分支，其中：本次从藏猪体内分离的菌株与伊朗家禽多杀性巴氏杆菌（AY225343）、伊朗牛多杀性巴氏杆菌（CP017961）、印度山羊多杀性巴氏杆菌（KX348143）、中国四川猪多杀性巴氏杆菌（KP222299）和中国湖南猪多杀性巴氏杆菌（KX449349）聚在一个分支，说明从藏猪体内分离的菌株与这几株菌具有一定的亲缘关系；而该分离菌株与外族肺炎克雷伯菌KJ803938 和JX195716不在一个分支上。

图2 多杀性巴氏杆菌的种特异性基因Kmt1与荚膜血清分型的PCR鉴定Fig.2 Identification of P. multocida Kmt1 gene and capsular serotype genes

2.4 药敏试验结果

图3 多杀性巴氏杆菌毒力基因检测Fig.3 Detection of P.multocida virulence genes

图4 藏猪多杀性巴氏杆菌与其他多杀性巴氏杆菌菌株的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of P.multocida isolated from Tibet swines and others

由表3 可见，本次从西藏地区藏猪体内分离的荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌对常用的4类11种抗菌药物的敏感性不同：对β-内酰胺类（阿莫西林和氨苄西林）和四环素类（四环素和多西环素）药物均产生耐药；在4 种氨基糖苷类药物中除对卡那霉素和新霉素呈中度敏感外，对其余的2种药物（链霉素和大观霉素）均敏感；对喹诺酮类药物（环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星）均敏感。

表3 分离菌的药敏试验结果Table 3 Drug sensitivity test results of isolated strains

3 讨论与结论

本研究利用细菌分离法从病死藏猪病料中分离出1 株猪源多杀性巴氏杆菌，并利用PCR 扩增对分离的菌株进行分子鉴定，同时，对其荚膜血清分型及毒力基因进行鉴定。有研究报道，我国猪多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型随着时间而变化：由20 世纪90 年代之前的A、B、D 型到21 世纪前10 年的D、A、B 型，再到2010 年以后的A、D 型；此外，近年来也有关于F 型的报道[14]。2015—2016 年王豪男[15]对我国14 省份临床诊断为肺炎的猪肺组织进行细菌分离及荚膜血清型鉴定，结果共发现A 型57 株（50%），D 型53 株（46%），说明猪源多杀性巴氏杆菌主要以荚膜血清A 型和D 型为主。本次从病死藏猪体内分离鉴定的多杀性巴氏杆菌属于荚膜血清D 型，这与我国近年关于猪多杀性巴氏杆菌的报道[16-19]一致。但目前对于西藏藏猪群体中多杀性巴氏杆菌荚膜血清分型鲜有报道，因此，无法追溯藏猪多杀性巴氏杆菌荚膜血清型的流行趋势。

多杀性巴氏杆菌毒力基因在该菌的致病过程中起到很重要的作用[3,20]。有报道显示，在多杀性巴氏杆菌中，毒力基因ptfA、fimA、hsf-2、exbB、exbD、tonB、Fur、sodA、sodC、ompA、ompH、oma87、plpB[21-22]等的检出率较高。本次从西藏藏猪体内分离的菌株中也检测到16 种多杀性巴氏杆菌毒力基因（PtfA、fimA、hsf-1、hsf-2、sodA、sodC、ompA、ompH、oma87、plpB、exbB、exbD、tonB、hgbA、hgbB、Fur），与以上研究结果基本一致。

对系统进化树的分析显示，本次从藏猪体内分离的菌株与伊朗家禽多杀性巴氏杆菌（AY225343）、伊朗牛多杀性巴氏杆菌（CP017961）、印度山羊多杀性巴氏杆菌（KX348143）、中国四川猪多杀性巴氏杆菌（KP222299）和中国湖南猪多杀性巴氏杆菌（KX449349）聚在一个分支，亲缘关系较近。

由细菌引起的呼吸道传染病是养猪业常发且主要流行的疫病之一。目前，抗菌药物治疗是控制细菌性传染病最有效的方法之一。然而，由于抗菌药物的广泛、滥用问题日益突出，导致细菌的耐药性问题越来越突出，使得细菌性传染病的危害日益严重，且在动物性食品中出现了兽药残留现象，对公共健康构成了潜在的威胁。本次西藏地区藏猪体内分离的荚膜血清D 型多杀性巴氏杆菌对常用的11 种抗菌药物产生了不同的耐药性，其中：对四环素、多西环素、阿莫西林和氨苄西林等4 种药物均产生耐药性，对卡那霉素和新霉素呈中度敏感，对链霉素、大观霉素、环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星等药物均敏感。因此，今后在养殖过程中对药物的使用必须合理且具有针对性，并经常更换抗菌药物种类，以免产生新的耐药菌株。

总之，多杀性巴氏杆菌是规模化猪场中一种重要的传染病，由于西藏地区藏猪养殖场对预防该病的疫苗使用率不高，导致该病时有发生，严重影响了藏猪群体的健康状况。目前，在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌荚膜血清型存在一定程度的多样性，其中荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌的比例较高。本试验从西藏地区病死藏猪体内也分离鉴定出荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌，为该病的预防和进一步研究奠定了基础；同时，本研究还初步探讨了藏猪荚膜血清D 型多杀性巴氏杆菌的药物敏感性，为该血清型多杀性巴氏杆菌的治疗提供了一定的理论依据。