瘤胃内甲烷生成与厌氧氧化过程耦联研究进展

2020-11-27 08:31徐欣欣王佳堃
关键词:产甲烷硫酸盐硝酸盐

徐欣欣,王佳堃

(浙江大学动物科学学院奶业科学研究所,杭州310058)

减少反刍动物甲烷产量能够提高饲料利用效率,且有利于保护生态环境。离子载体[1]、有机酸[2]、卤代化合物[3]等化学物质,皂苷[4]、单宁[5]、蒽醌[6]等植物提取物,及细菌素[7]、驱原虫剂[8]、产甲烷菌疫苗[9]等生物方法都曾是反刍动物甲烷减排的热点技术,但在动物养殖过程中这些方法又受限于纤维消化的抑制或降甲烷效果瞬时性的影响。体外瘤胃发酵证实,添加硝酸盐和硫酸盐降甲烷效果显著,推测这一过程是通过硝酸盐和硫酸盐还原途径与甲烷生成途径竞争氢来实现的[10]。而事实上,NO-3和SO2-4是多种环境中甲烷厌氧氧化(anaerobic methane oxidation, AMO)的电子受体,在NO-3或SO2-4存在时,甲烷氧化菌可以将甲烷氧化[11]。其中反向产甲烷途径是AMO的方式之一。即参与甲烷生成的酶是一类“双向酶”,它们既参与产甲烷菌利用氢气和二氧化碳生成甲烷的生成过程,也参与以甲烷为底物生成二氧化碳的AMO 过程[11]。每年自然环境中有0.3 Gt 的甲烷经厌氧氧化途径被消耗[12]。而在反刍动物的瘤胃中,尤其是在添加硝酸盐和硫酸盐的情况下,甲烷生成量的减少是竞争氢的结果,还是甲烷氧化的结果,不得而知。因此,深入研究在自然环境和瘤胃2 种不同生境下AMO 途径中硝酸盐和硫酸盐对甲烷生成量差异的影响,能够更好地阐释硝酸盐和硫酸盐抑制瘤胃甲烷排放的内在机制。

1 自然环境中甲烷厌氧氧化途径

AMO 是沼泽、湿地、农田土壤、水底淤泥等厌氧环境中甲烷排放量降低的主要因素,且AMO 普遍存在于这些生境中(表1)。AMO 途径依据其末端电子受体类型可以分为硫酸盐依赖型甲烷厌氧氧化(sulfate-dependent anaerobic methane oxidation,S-DAMO)、硝酸盐/亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化(nitrate/nitrite-dependent anaerobic methane oxidation,N-DAMO)及金属依赖型甲烷厌氧氧化(metaldependent anaerobic methane oxidation,M-DAMO)。

1.1 硫酸盐依赖型甲烷厌氧氧化(S-DAMO)

S-DAMO 是甲烷厌氧氧化古菌(anaerobic methanotrophic archaea, ANME)和硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)以SO2-4为终端电子受体,经硫酸盐还原反应将甲烷氧化为HCO-3和HS-的过程。目前,该过程有反向产甲烷、乙酸化与甲基化3种假说途径。

表1 不同类型甲烷厌氧氧化途径中甲烷氧化速率Table 1 Methane oxidation rates in the different types of anaerobic methane oxidation processes

根据系统发育分析,在与SRB共生的ANME类群中,ANME-1 与产甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)和产甲烷微菌目(Methanomicrobiales)的亲缘关系较远[19-20],ANME-2 属于产甲烷八叠球菌目[20],ANME-3 与拟甲烷球菌属(Methanococcoides)的亲缘关系较近[20],其中ANME-2 可以再细分为ANME-2a、ANME-2b、ANME-2c[21]和ANME-2d[22]。ANME-2d 也被称为GoM-ArcⅠ[23]或AAA 古菌[24]。在S-DAMO 中,与ANME-1 和ANME-2 共 生 的SRB 通常属于脱硫八叠球菌属(Desulfosarcina)和脱硫球菌属(Desulfococcus)[19-20,25],与ANME-3共生的SRB一般属于脱硫叶菌属(Desulfobulbus)[26-27]。

如图1 所示,甲烷生成途径中大部分酶催化的反应都是可逆的[11],反向产甲烷理论正是以此为基础提出的。甲烷生成途径的最后一步是甲基辅酶M 还原酶(methyl-coenzyme M reductase,Mcr)将辅酶M(coenzyme M, CoM)连接的甲基催化为甲烷[21],而在反向产甲烷途径中,Mcr被证实是活化甲烷即催化AMO 的关键酶[28]。除亚甲基四氢甲烷蝶呤还原酶(methylene-H4MPT reductase,Mer)和一些氢化酶的编码基因外,ANME-1的基因组具有编码二氧化碳还原生成甲烷的其他全部酶基因[29]。因此,在基因层面上,反向产甲烷途径中的大部分环节都能在ANME-1 中实现,表明ANME-1 与SRB至少能通过部分反向产甲烷途径完成S-DAMO。Mcr 的可逆性及甲烷生成所需的关键酶基因的存在[28-30],都支持了反向产甲烷途径。但有研究发现,在低氢、高甲烷含量的环境中无法成功诱导反向产甲烷途径[31]。通过系统发育分析和显微镜观察发现,与产甲烷八叠球菌目有较近亲缘关系的古菌参与了某些环境中的S-DAMO[32],但许多产甲烷八叠球菌目的微生物不能利用氢气完成产甲烷过程,而是更倾向于在富含甲基化合物和乙酸的环境中生长[33]。出于对以上几点的考虑,VALENTINE 等推测可能存在其他途径供ANME 与SRB 完成SDAMO[33],并由此提出乙酸化理论。乙酸化理论包括2种代谢途径,都涉及甲烷的氧化与乙酸的生成,但ANME 是直接将2 分子的甲烷氧化为乙酸和氢气,还是利用二氧化碳将甲烷转化为乙酸[33],尚需要系统的研究。

除反向产甲烷理论与乙酸化理论外,甲基化理论作为一种新的AMO 理论模型也被用于解释AMO[34]。从热力学角度来看,当海洋环境中氢气浓度超过0.29 nmol/L时,S-DAMO会受到抑制[35]。但MORAN 等[34]接种来自Eel 河盆地和水合物脊(hydrate ridge)的沉积物后发现,0.43 mmol/L 的氢气浓度并不抑制S-DAMO,说明氢气并非是SDAMO的产物;因此,作者推断在S-DAMO过程中存在其他电子传递体。然而,当MORAN 等向培养体系中添加甲硫醇(MeSH)时,S-DAMO 的反应速率降低了68%,由此推断甲基硫化物充当了这一过程中的电子传递体,从而提出了甲基化理论。即甲烷与辅酶M(CoM)结合时被活化并释放电子,此时HCO-3作为电子受体,在碳酸酐酶作用下转化为二氧化碳,二氧化碳被ANME利用后还原为甲基化合物并与CoM 结合,硫化物取代结合物中的CoM,再次释放的CoM 可再被作用于甲烷活化和二氧化碳还原,而甲基硫化物则充当这一过程中的电子传递体并被SRB利用,其与SO2-4反应后产生的HCO-3和HS-又可用于AMO的起始阶段[34]。不同环境下SDAMO的发生机制可能存在一定的差异,而具体是通过哪一种机制来完成AMO 过程,尚需要在不同试验条件下进行验证。

1.2 硝酸盐/亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化(NDAMO)

N-DAMO 常在湿地[15]和淡水[36]等缺氧且富含NO-2或者NO-3的区域发生,是ANME和NC10门细菌(CandidatusMethylomirabilis oxyfera,M.oxyfera)以NO-2或NO-3作为电子受体,与脱氮耦联并将甲烷氧化为二氧化碳的过程。1991年,SMITH等在富含硝酸盐的地下水域中监测到了甲烷氧化的发生,由此推测NO-3也许能够作为电子受体,将反硝化与甲烷氧化耦合[37]。之后,RAGHOEBARSING 等通过对河流的厌氧沉积物进行富集培养,发现该富集培养物由1种细菌和1种与ANME-2亲缘关系较远的古菌组成,其在厌氧条件下能够完成甲烷氧化和反硝化,故认为在N-DAMO中,首先由古菌完成甲烷的氧化,再将电子传递给NC10 门细菌以完成NO-3和NO-2的还原[16]。ETTWIG 等在抑制Mcr 的条件下培养由NC10门细菌和产甲烷八叠球菌目的古菌组成的富集培养物,发现培养体系中甲烷和亚硝酸盐的转化速率保持稳定,古菌在培养过程中逐渐消失;由此推断,N-DAMO 过程主要由NC10 门细菌完成,并且NO-2比NO-3更适合作为该培养体系的电子受体[36]。借助同位素标记法,ETTWIG等在同时存在甲烷和亚硝酸盐的体系中培养M.oxyfera,监测到了甲烷的氧化和氮气的生成[40]。基因组及转录组等组学技术揭示了M. oxyfera具有还原NO-3、NO-2和NO 的基因,能够使2 分子NO 转化为N2和O2,而不是将NO转化为N2O,但M.oxyfera缺少目前已知的编码N2O还原酶的基因[40]。HAROON等[30]发现:在淡水沉积物与厌氧废水污泥的两者混合物中,占主导地位的ANME-2d 的基因组信息中包括所有Mcr 亚单位基因(McrABCDG)及F420依赖型Mer 在内的完整的反向产甲烷途径[30];同位素标记试验结果表明,ANME-2d 能够利用NO-3作为电子受体,独立完成AMO 过程(图1),完整的固碳途径和乙酰辅酶A合成酶也存在于ANME-2d的基因组中,暗示其具有产生乙酸的可能性。

图1 硝酸盐或亚硝酸盐竞争氢气、氢营养型甲烷生成途径及反向产甲烷途径[21,30,38-39]Fig.1 Nitrate and nitritecompetition for hydrogen,hydrogenotrophic methanogenesis and reverse methanogenesis processes[21,30,38-39]

1.3 金属依赖型甲烷厌氧氧化(M-DAMO)

除S-DAMO 和N-DAMO 外,研究者发现,在湖泊[41]、湖水[42]及海岸[18]等生境中,AMO 还与金属离子还原耦合,尤其是与Fe3+和Mn4+的还原反应[43]。从热力学角度来看,金属离子比硫酸盐更适合作为AMO过程中的电子受体(表2)。

ETTWIG 等在连续通入甲烷、亚硝酸盐和硝酸盐的河流沉积物中,富集到了一种与硝酸盐型甲烷厌氧氧化菌(CandidatusMethanoperedens nitroreducens)相关的古菌群——AAA 簇古菌(ANME-2d),发现该古菌群能够直接耦合甲烷的氧化及Fe3+和Mn4+的还原[43]。BEAL 等发现:河流盆地沉淀物中的微生物能够利用Fe3+和Mn4+氧化甲烷[14];通过16S rRNA 和Mcr-A 的多样性分析发现,培养体系中同时存在ANME 及大量的细菌,拟杆菌属(Bacteriodes)和酸杆菌门(Acidobacteria)等中约40%的细菌能够还原Mn4+,表明Mn4+依赖型AMO不是由ANME 单独完成的,其中Mn4+还原菌在此过程中发挥着重要作用;此外,随培养时间的延长,ANME-2的数量显著下降,ANME-3的数量显著增加,而ANME-1 的数量始终保持稳定,说明Mn4+依赖型AMO 主要由ANME-1 和ANME-3 及某些Mn4+还原菌共同完成。SCHELLER 等将柠檬酸铁添加至包含ANME-2a和ANME-2c的培养体系中,发现在Fe3+作为唯一电子受体时能够监测到AMO[44]。CAI 等利用同位素标记,发现淡水沉积物中存在由ANME 独立介导完成的Fe3+依赖型AMO,且该培养体系中ANME 的基因组信息表明其具有编码反向产甲烷途径的所有基因[45];因此,在基因层面,ANME 能够利用反向产甲烷途径完成AMO。SOO 等将ANME-1 编码Mcr的基因克隆到醋酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)中,在甲烷作为碳源与Fe3+作为电子供体的条件下,结合同位素示踪试验,发现甲烷的消耗伴随着乙酸盐的增加,推测醋酸甲烷八叠球菌能够逆转乙酸营养型甲烷生成途径以完成AMO[46]。

2 瘤胃中硝酸盐和硫酸盐还原反应

在反刍动物瘤胃中,产甲烷菌能够利用氢气与发酵产物作为底物生成甲烷,这在一定程度上稳定了瘤胃内的氢分压,也为瘤胃内微生物的生存提供了保障。通过二氧化碳-氢气反应生成的甲烷占瘤胃甲烷生成量的82%[47]。硫酸盐和硝酸盐等能够与二氧化碳竞争氢气,从而降低甲烷的产量。从热动力学角度(表2)来看,由硝酸盐还原菌和硫酸盐还原菌介导的还原反应比氢营养型甲烷生成反应更有优势[48],因此,在饲料中添加硝酸盐和硫酸盐是反刍动物甲烷减排的研究热点。

表2 利用不同电子受体进行的还原或氧化反应的吉布斯自由能[11,14,48,50]Table 2 Gibbs free energy for reduction or oxidation reactions using different electron receptors[11,14,48,50]

硫酸盐作为最终电子受体被还原成H2S,这一过程在热动力学上略次于硝酸盐还原反应[48]。VAN ZIJDERVELD 等发现:补饲2.6%的硫酸盐能降低绵羊16%甲烷产量;2.6%硝酸盐与2.6%硫酸盐联用时,甲烷产量降低程度可高达47%;但单独添加硫酸盐的降甲烷效果不如单独添加硝酸盐[10]。许多关于硝酸盐和硫酸盐的研究均获得了较为理想的降低甲烷产量的效果(表3)。

3 自然环境和瘤胃中硝酸盐和硫酸盐还原反应降低甲烷产量的差异

目前,从瘤胃中分离出来的产甲烷菌主要有产甲烷杆菌属(Methanobacterium)、产甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、产甲烷微菌属(Methanomicrobium)和产甲烷八叠球菌属(Methanosarcine)[53-54],其中大部分都通过还原二氧化碳来产生甲烷。甲烷的形成伴随着细胞膜内外Na+和H+化学梯度的形成,两者分别由Na+泵-甲基辅酶M转移酶(methyl-H4MPT: CoM methyltransferase,Mtr)和细胞膜上的氢化酶来实现。Na+和H+梯度驱动位于膜上的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)合酶,通过产生ATP 来实现能量转换[55]。反向产甲烷途径逆转了甲烷生成的过程,在Mcr等一系列关键酶的催化下将甲烷氧化为二氧化碳[30]。HAROON 等通过ANME-2d 的基因组信息发现,ANME-2d 利用反向产甲烷途径氧化甲烷过程中的能量转换与甲烷生成过程类似,同样是通过跨膜化学浓度梯度驱动膜上的ATP合成酶,最终产生ATP[30]。而ETTWIG等的研究表明,M.oxyfera在还原N时产生O2,进而用于甲烷氧化并获取能量[40]。WU 等进一步细化了M.oxyfera的中心分解代谢和能量代谢通路,发现甲烷在颗粒性甲烷单加氧酶(particulate methane mono-oxygenase, PMMO)的催化下转化为甲醇,再经甲醇脱氢酶(methanoldehydrogenase,Mdh)、亚甲基-四氢甲基蝶呤脱氢酶(methylene-H4MPT dehydrogenase, MtdB)或亚甲基-四氢叶酸脱氢酶(methylene-H4F dehydrogenase,FolD)一系列酶的作用形成甲酸,再由甲基脱氢酶(formate dehydrogenase,Fdh)催化甲酸转化为二氧化碳[61]。N经一系列酶催化后,最终转化为N2和O2,其中3/4 的O2被用于甲烷的氧化,1/4 的O2被用于产能代谢等其他生化过程[61-62]。M. oxyfera作为呼吸型微生物,其通过化学渗透机制保存来自NDAMO产生的能量,以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)脱氢酶耦合还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)的氧化和醌的还原,通过质子的泵出实现跨膜H+梯度进而合成ATP;细胞色素bc1复合体对还原性醌进行氧化,可再次实现H+的跨膜转移,而细胞色素c作为电子供体将电子传递给cd1型亚硝酸还原酶,进行实现N的还原[61-62]。

表3 添加硝酸盐或硫酸盐降低瘤胃甲烷产量的研究Table 3 Studies of reducing methane production in rumen by adding nitrate or sulfate

4 小结

硝酸盐或硫酸盐等可替代电子受体来降低瘤胃甲烷产量的原因是多样的,如硝酸盐既可通过竞争氢气实现瘤胃甲烷产量的降低,也可通过对瘤胃产甲烷菌的毒性作用抑制甲烷生成。AMO 作为环境中减少甲烷排放的重要途径之一,其与硝酸盐或硫酸盐影响瘤胃甲烷产量是否存在一定联系尚未可知,但N-DAMO 微生物在瘤胃中的发现说明AMO 可能在瘤胃中发生。同位素示踪技术与体外试验相结合,可以直观地监测瘤胃微生物是否将甲烷氧化为二氧化碳;而添加硝酸盐等使瘤胃中AMO 微生物数量增加,能够再度监测甲烷的转化过程;另外,宏基因组技术与其他组学技术相结合,可以深度分析何种瘤胃微生物通过何种途径实现了甲烷氧化为二氧化碳的过程,这也是打破硝酸盐降低瘤胃甲烷生成量传统认知的关键。这些研究将为开发瘤胃甲烷减排措施提供更广阔的思路,对提高饲料利用效率和减缓甲烷对温室效应的影响具有重要意义。

表4 硝酸盐和硫酸盐在自然环境和瘤胃中对甲烷产量影响的差异[10-11,48,50]Table 4 Differences in the effects of nitrate and sulfate on methane production in natural habitats and rumen[10-11,48,50]

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