HPLC法测定利咽含片中绿原酸含量

王欢欢，黄晓舞，白 林（中国人民解放军总医院制剂中心，北京 100853）

利咽含片是解放军总医院非标准制剂品种，处方由青果、金银花、薄荷脑等组成，具有清热解毒，消肿止痛，化痰止咳，生津润燥的作用。用于肝肾阴虚型慢性咽喉炎引起的咽喉肿痛，干咳无痰，咽干喑哑等症。临床使用多年，质量可靠，疗效安全。该制剂现行标准较低，没有含量测定项，为了更好的控制其内在质量，本研究采用HPLC法对利咽含片中绿原酸含量进行测定，旨为更好地控制利咽含片的质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

XS105型电子天平（梅特勒精密仪器有限公司）；Agilent 1260液相色谱仪（美国Agilent公司）；KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；列孔型电热恒温水浴锅（天津市中环科技开发公司）。

1.2 材料

利咽含片（解放军总医院，批号：LYP170401、LYP170501、LYP170502、LYP170503）；绿原酸对照品（批号：110753-201716）购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为高纯水，硅胶G板（青岛海洋化工厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验[1]

色谱柱：Agilent EclipseXDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：327 nm；进样量：10 μL。理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于1000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取绿原酸对照品（批号：110753-201716，含量按99.3%计）10.06 mg置50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取储备液5 mL，置25 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，制成每1 mL含39.96 μg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取利咽含片（批号：LYP170401），研细，取约0.45 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理20 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取缺少金银花和桑葚药材的阴性样品，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性实验

取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果显示，供试品中绿原酸与对照品在相同保留时间处有相同色谱峰，峰形良好，与其他组分峰基线分离度较好，且阴性样品无干扰。

2.4 标准曲线的制备

精密量取储备液适量，分别加50%甲醇稀释配成不同浓度的对照品溶液。分别精密量取储备液和不同浓度对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得绿原酸回归方程：Y= 5.561 26×105X- 4.593 85×105（r= 0.999 9）。结果表明：绿原酸的浓度在9.989 6 ～199.791 6 μg·mL-1范围内峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度实验

取绿原酸对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，绿原酸峰面积的RSD为0.15%（n= 6），表明仪器精密度良好。

图1 绿原酸高效液相色谱图A - 供试品，B - 绿原酸对照品，C - 阴性对照；1 - 绿原酸Fig 1 HPLC chromatograms of chlorogenic acid A - test samples, B - chlorogenic acid control, C - negative control;1 - chlorogenic acid

2.6 重复性实验

精密称取利咽含片（批号：LYP170401）供试品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果显示，绿原酸含量平均值为每片5.89 mg，RSD为0.17%（n= 6），表明本方法重复性良好。

2.7 中间精密度实验

取利咽含片（批号：LYP170401）细粉适量，在不同时间，由不同的实验人员，使用不同型号高效液相色谱仪，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明，含量测定中间精密度实验RSD值为1.11%（n= 6），表明该方法测定本品含量时中间精密度良好。

2.8 回收率实验

精密称取利咽含片（批号：LYP170401）细粉约0.22 g，置具塞锥形瓶中，加入浓度为42.222 4 μg·mL-1的绿原酸对照品溶液25 mL，再精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，平行制备6份供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果见表1。

表1 回收率测定结果. n = 6Tab 1 Results of recovery tests. n = 6

2.9 稳定性实验

取“2.2.2”项下供试品溶液，室温放置，分别于0、3、6、9、13、16、19、21、24、27 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，绿原酸峰面积RSD为0.53%（n= 10），结果表明供试品溶液在室温放置27 h内稳定。

2.10 样品中绿原酸含量测定

取三批中试样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果. n = 3Tab 2 Results of content determination of samples. n = 3

3 讨论

3.1 专属性考察[2-3]

在含量测定专属性实验中，分别取处方中各药材细粉约0.5 g，置具塞锥形瓶中，按照供试品处理方法制备各药材溶液，按“2.1”项下色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果桑葚溶液中在与对照品色谱峰相应的位置有相同色谱峰，表明桑葚药材中也含有绿原酸，故制备缺少金银花及桑葚两味药材的阴性对照溶液，测定利咽含片中金银花及桑葚两味药材中总的绿原酸含量。

3.2 提取方法和时间考察[4-7]

在供试品制备过程中，比较了甲醇和50%甲醇两种提取溶剂，结果显示50%甲醇提取效果较好。故确定本品溶剂为50%甲醇。同时考察了不同提取时间（20 min、30 min、40 min）对含量的影响，结果表明超声提取20 ～ 40 min时供试品中绿原酸含量基本一致，故确定本品提取时间为20 min。

3.3 流动相考察[1]

参照《中国药典》（2015年版）一部金银花药材标准，以乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）为流动相，结果表明供试品中绿原酸峰与相邻杂质峰分离度达不到要求，通过试验，以乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）为流动相，供试品中绿原酸峰与相邻杂质峰分离度可达到要求。故确定本品流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）。

3.4 系统耐用性考察

为了考察微小变动因素对本品含量测定的影响，调节流速（0.9、1.0、1.1 mL·min-1）、柱温（25、30、35 ℃）和流动相比例（8∶92、10∶90、12∶88）进行试验（RSD =0.36%，n= 7），结果表明，在测试条件有微小变动时，测定结果基本不受影响，此测试条件的耐用性良好。

3.5 含量限度考察

根据含量测定数据，结合大生产工艺因素及不同批次间药材含量高低差异，以及成品片重差异合理范围等影响含量变化的因素，为确保成品质量，暂定本品每片含绿原酸（C16H18O9）不得少于2 mg。