双向电泳技术鉴别牛羊乳品真实性

刘鸣畅，侯艳梅，王 斌，杨艳歌，吴亚君,*

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.海普诺凯营养品有限公司，湖南 长沙 410005）

随着食品多样化发展，高端乳及其制品产业发展迅速，羊乳作为高端小众乳品以其致敏性低、营养成分易于吸收等特点受消费者青睐，这大大促进了羊乳及其制品产业的发展，销量也逐年增加[1-2]，销售额从2012年的20万 元增长至2016年的52亿 元[3]。但是在经济利益驱动下，一些不法商贩将牛乳或牛乳蛋白添加到羊乳等高值乳品及其制品中牟取利益[4-6]。为规范产业发展，保护消费者权益，2015版《食品安全法》中明确规定，禁止生产经营“掺杂掺假”食品，从法律层面将食品安全提升到更重要的位置，表明了打击食品造假掺假、保障老百姓食品安全的决心。在2016年6月，国家食品药品监督管理总局加强对婴幼儿配方粉等特殊食品的监管力度，颁布了《婴幼儿配方乳粉产品配方注册管理办法》，其中明确规定婴幼儿配方乳粉原料为羊乳（粉）的，产品名称可标注为婴幼儿配方羊乳粉，并且应当在配料表中标明每100 g产品中羊乳（粉）所占比例，以及乳清蛋白粉来源。这一系列举措，反映出2008年以来，监管部门对乳品尤其婴幼儿配方粉安全的重视，也增加了企业约束力，增强了消费者信心。

目前，已经报道了一系列乳源成分核酸[7-8]、蛋白[9]、理化[10-12]、免疫[13-14]等检测方法。Banerjee等[15]通过对线粒体DNA的D-loop区核酸片段进行特异性扩增，可检测到液态乳或乳酪中0.1%的牛源性成分；Chen Renkun等[16]采用高效液相色谱与电喷雾-质谱联用技术，可以精准检测到羊乳中含量不小于5%的牛乳成分；Chen Qi等[17]采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法技术，通过对β-乳球蛋白特征肽段定量检测，实现对羊乳及其制品中牛乳成分的精准定量检测；Anguita等[18]针对牛乳β-酪蛋白制备单克隆抗体，制备酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒，可对鲜乳及乳酪中的牛源β-酪蛋白成分进行检测。不同方法应用范围不同，各有优缺点，核酸检测灵敏度高，可检测出较低成分的掺假物，但是由于婴幼儿配方乳粉生产工艺复杂，物料多样，容易造成交叉污染，因其中辅料的添加产生假阳性信号。ELISA检测简单快速，可作为快速筛查手段，但是现有市场上的抗体种类以及ELISA检测产品范围有限，而且对抗体质量依赖性较高，不利于大范围推广。液相色谱-质谱联用技术可实现精准定量检测，适合作为确证方法，但液相色谱-质谱联用首先要通过蛋白酶将乳蛋白进行酶切，而婴幼儿配方粉经过复杂加工工艺，其原料生产、贮存以及乳粉生产工艺的差别可导致不同程度的美拉德反应[19]，这会造成酶切位点修饰，影响酶切效率，此外，液相色谱-质谱联用技术采用靶标肽段检测，对于未知物种来源或未知加工方式的样品难以检测。

双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2DGE）作为研究蛋白质组的重要技术之一[20]，1975年由O’Farrell发明，并成功对大肠杆菌蛋白进行了分离[21]。2DGE技术把复杂蛋白混合物中的蛋白质在第一向等电聚焦电泳和第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）2 个维度上进行分离[22]，从而达到良好的分离效果，获得更全面、更丰富的蛋白质信息，已经在医学、动物学、植物学、微生物学等多个领域得到很好的应用[23-25]。2DGE技术可以直观地展现不同种类、来源食品蛋白的差异[26]，本实验室也采用2DGE技术实现燕窝真伪识别[27]，并制定出入境检验检疫行业标准；建立蜂王浆蛋白质组检测的2DGE方法[28]，评价蜂王浆新鲜度，丰富了蜂王浆新鲜度检测指标。

本研究采用2DGE技术，对牛乳、羊乳及其制品进行分析，发现不同乳源乳品蛋白差异。同时通过对梯度配比的羊乳婴幼儿配方粉与牛乳婴幼儿配方粉以及市售样品的检测，验证2DGE技术可以作为评价牛羊乳真伪的一个重要手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

婴幼儿配方羊乳粉、羊乳清粉、牛乳清粉、巴氏杀菌羊乳 海普诺凯营养品有限公司；牛乳配方粉样品、液态牛乳 市购。

预染蛋白分子质量标准、两性电解质（Bio-Lyte 4/6 Ampholyte、Bio-Lyte 5/7 Ampholyte）、IPG预制胶条（7 cm，pH 4～7）、30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L三羟甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）溶液（pH 8.8）、四甲基乙二胺、二硫苏糖醇、3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐 美国Bio-Rad公司；BCA蛋白定量试剂盒 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

Labsystems Multiskan Spectrum酶标仪 美国Thermo公司；5418R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Mini Protean 3 Cell垂直板电泳仪、PharosFX激光成像系统美国Bio-Rad公司；MS3涡旋仪 德国IKA公司；HH-1数显恒温水浴锅 金坛市白塔新宝仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

称取1.5 g婴幼儿配方乳粉样品置于15 mL离心管中，加10 mL去离子水，涡旋振荡，至充分溶解。使用BCA蛋白定量试剂盒对鲜乳样品和乳粉样品溶液的总蛋白进行测定，将蛋白质量浓度调整为20 mg/mL，于4 ℃保存，备用。

1.3.2 等电聚焦电泳

将样品从4 ℃取出，涡旋振荡，吸取10 μL样品和150 μL水化液（8 mol/L尿素、4% 3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐、40 mmol/L Tris、100 mmol/L二硫苏糖醇、0.5%两性电解质）混匀，使用IPG胶条进行等电聚焦电泳。条件设定为50 V主动水化8 h；250 V线性30 min；500 V快速30 min；4 000 V线性3 h；4 000 V快速40 000 V·h。

1.3.3 SDS-PAGE

SDS-PAGE参照《蛋白质技术手册》[29]中相关内容进行。其中分离胶浓度为12%。电泳条件为10 mA恒流电泳。电泳完毕，凝胶用考马斯亮蓝染液（50%甲醇、10%醋酸、0.25%考马斯亮蓝R250）染色1 h，用脱色液（25%甲醇、10%醋酸）脱色至凝胶背景消失，用蒸馏水浸泡1 h，随后用凝胶成像系统拍照。

1.3.4 凝胶扫描及分析

将脱色并经过蒸馏水浸泡的凝胶放入PharosFX激光成像系统，收集2DGE图谱，使用PDQuest软件进行图谱定量比较分析。

2 结果与分析

2.1 方法重复性结果

图1 液态乳样品图谱重复性结果Fig. 1 2DGE maps of liquid cow milk repeatability evaluation in 3 independent experiments

为确保所采用的方法在蛋白组分分析中有良好的重复性，对同一份液态乳样品进行3 次独立重复2DGE分析，如图1所示，蛋白点的位置与数量均保持一致，表明方法的重复性良好。分别测定图1中高丰度蛋白点P1和低丰度蛋白点P2对其绝对光密度（蛋白点光密度×蛋白点面积）和相对光密度（蛋白点光密度×蛋白点面积与图谱总蛋白点的平均光密度×蛋白点面积的比值）的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果如表1所示，P1和P2蛋白点3 次相对光密度的RSD低于绝对光密度的RSD，说明2DGE蛋白点相对光密度重复性最优。

表1 光密度重复性实验结果Table 1 Repeatability of optical density values in replicate experiments

2.2 牛羊乳特征蛋白筛选结果

图2 牛羊乳及其制品2DGE图谱Fig. 2 2DGE maps of cow and goat milk and milk products

如图2所示，通过与现有研究[29]比对，牛乳、羊乳中所含蛋白种类基本相同，但由于性质差异，在液态乳和婴幼儿配方粉的图谱中可以发现，酪蛋白中牛源αS1-酪蛋白（cow αS1-casein，C-αS1-CN）和羊源αS1-酪蛋白（goat αS1-casein，G-αS1-CN）等电点基本相同，但C-αS1-CN分子质量大于G-αS1-CN；牛源αS2-酪蛋白（cow αS2-casein，C-αS2-CN）和羊源αS2-酪蛋白（goat αS2-casein，G-αS2-CN）分子质量相同，但G-αS2-CN等电点更大；牛源β-酪蛋白（cow β-casein，C-β-CN）和羊源β-酪蛋白（goat β-casein，G-β-CN）的分子质量和等电点基本相同。乳清蛋白中，牛源β-乳球蛋白（cow β-lactoglobulin，C-β-LG）和羊源β-乳球蛋白（goat β-lactoglobulin，G-β-LG）分子质量相同，G-β-LG等电点大于C-β-LG；牛源α-乳白蛋白（cow α-lactalbumin，C-α-LA）和羊源α-乳白蛋白（goat α-lactalbumin，G-α-LA）的分子质量和等电点基本相同。但是，每种乳在加工过程中，蛋白变化较小，所以初步选定C-αS1-CN、牛源κ-酪蛋白（cow κ-casein，C-κ-CN）、G-αS2-CN和G-β-LG作为乳源特征蛋白，判别羊乳婴幼儿配方粉中是否添加牛乳成分。

2.3 检测灵敏度结果

为考察乳源标志蛋白点C-αS1-CN、C-κ-CN、G-αS2-CN和G-β-LG的最低检测限及线性关系，将羊乳婴幼儿配方粉与牛乳婴幼儿配方粉进行梯度配比，使牛乳婴幼儿配方粉质量分数分别为0%、5%、10%、20%、50%、80%、95%、100%，并进行2DGE实验，结果如图3所示，通过PDQuest软件分析，确定蛋白点光密度，并绘制工作曲线，如图4所示。

图3 不同配比梯度的乳粉样品2DGE图谱Fig. 3 2DGE maps of different proportions of cow milk powder

图4 不同配比梯度的乳粉样品牛羊乳特征蛋白光密度Fig. 4 Optical density values of different proportions of characteristic protein components in cow milk and goat milk

结果表明，C-αS1-CN、C-κ-CN、G-αS2-CN和G-β-LG蛋白的检测灵敏度均可达到5%，其中，C-αS1-CN蛋白线性关系良好，线性相关系数可达0.97，可作为牛乳成分指征蛋白；G-β-LG蛋白线性关系良好，线性相关系数可达0.98，可作为羊乳成分指征蛋白。C-κ-CN和G-αS2-CN蛋白特异性良好，但线性关系较差，可作为乳源判定的辅助指标。

2.4 市售样品检测结果

图5 市售样品2DGE图谱Fig. 5 2DGE maps of commercialized samples

表2 市售样品检测结果Table 2 2DGE detections of commercialized milk samples

从市场上购买8 份样品，包括1 个液态羊乳产品、2 个液态牛乳样品，1 个羊乳婴幼儿配方粉产品、1 个牛乳婴幼儿配方粉产品，2 个酸羊乳产品和1 个酸牛乳产品采用2DGE方法进行检测，结果如图5、表2所示。可以看出，市售液态羊乳、羊乳婴幼儿配方粉和酸羊乳1中，均存在羊乳特征蛋白G-β-LG，可判定为羊乳产品。市售液态牛乳、牛乳婴幼儿配方粉和酸牛乳中，可检测到牛乳特征蛋白C-αS1-CN和C-κ-CN，可判定为牛乳产品。而酸羊乳2中，未检测到羊乳特征蛋白G-β-LG，而牛乳特征蛋白C-αS1-CN和C-κ-CN清晰可见，判断其为牛乳伪造的羊乳产品。

3 讨论与结论

蛋白质组分析技术越来越多地应用于食品检测。虽然相比于质谱技术，2DGE技术对手工操作依赖较大，似乎容易出现结果不稳定的情况[30]。但本实验研究表明，通过购买、配制标准化试剂，严格遵守标准操作规程，可以达到良好的重复性。采用相对定量方法时，蛋白点相对光密度比较稳定，说明相对定量法可用于模拟掺假样品中掺假物的半定量检测。但是由于不同乳制品及不同厂家加工工艺差异较大，对蛋白质可能造成不同程度的影响，此外，营养强化蛋白的添加也可能造成蛋白比例的变化[31]，所以本方法不适于用作乳制品掺假成分的定量检测。通过与已开展的牛羊乳相关2DGE研究结果[32]对比，发现本实验得到的牛、羊乳蛋白指纹图谱和报道的图谱基本相同。牛、羊乳蛋白指纹图谱之间存在明显差异，主要体现在αS1-酪蛋白分子质量不同，αS2-酪蛋白、κ-酪蛋白以及β-乳球蛋白等电点不同，为牛羊乳制品中的鉴定提供了很好的指标。2DGE利用等电点和分子质量二维的信息，对蛋白的判定比较准确，加上在检测过程中，不存在类似聚合酶链式反应这种指数放大信号，或者类似ELISA依赖抗体质量的情况，因此不会发生交叉污染或假信号的情况，可以作为样品鉴定的确证方法。相比于质谱技术，虽然前者通量更高，但2DGE具有直观地在同一张图谱上呈现样品所有蛋白点的优点还是其他技术无法比拟的，这种直观性和完整性在不同样品之间的比对，尤其是未知标志蛋白，或未知样品来源的情况下，尤其具有优势。同时，2DGE与质谱，主要是基质辅助激光解吸电离-飞行质谱的良好衔接也为后续的蛋白精准鉴定提供条件。

虽然2DGE技术相比于质谱技术，在复杂样品（掺杂）的鉴定上存在识别难度，不同物种或组织来源蛋白分辨率不够高，但是对于乳品蛋白，蛋白种类相对较少，酪蛋白和清蛋白分区明显，体现在图谱上就是蛋白点数量较少，分布区域清晰，差异明显，加上乳品样品前处理简单，无需复杂的酶解过程，不会造成处理过程中蛋白的损失，对指纹图谱的模式影响小，因此适用于2DGE技术。通过构建2DGE标准图库，也可以减少检测过程中对标准样品的依赖，适合市售商品的常规检测。

通过梯度配比实验，即可判定乳品中质量分数不小于5%的牛乳蛋白成分，能够满足市售样品掺伪监管需求。其中C-αS1-CN和G-β-LG相对含量和乳粉的掺杂比例具有良好的线性关系，可以用于定量检测。针对8 份市售样品的检测，发现1 份用牛乳冒充羊乳，整个判定过程清晰直观，一方面说明本方法对实际产品和不同类型产品的适用性，另一方面也说明市场的确存在不同物种来源乳品的掺假。在后续的研究中，本课题组将扩大对市场样品的筛查范围，同时探索定量检测方法，更精确地判定商品标识的真实性。

2DGE图谱信息丰度高、结果稳定直观，通过对图谱中牛乳特征蛋白点的识别，即可判定乳品中质量分数不小于5%的牛乳蛋白成分，可以作为评价羊乳真伪的确证方法。