基于转录组研究MPEF 对毕赤酵母的致死机理

朱 宁，于 宁，朱 月，韦玉龙，张嘉颖，孙爱东*

（北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

毕赤酵母是引起酸性果汁腐败变质的主要微生物之一[1]，对果汁产业的发展极为不利。高压脉冲电场（pulsed electric field，PEF）技术作为一种新型非热加工技术，在保证食品安全的同时，能最大程度地保持其原有的色、香、味及营养品质[2-3]。PEF是通过高电压获得高场强，高压脉冲发生器成本较高，长期使用易产生氧化性物质等[4]，这些问题限制了PEF在实际生产中的应用，因此，实现低电压下的脉冲电场杀菌成为当前PEF研究领域的热点。

随着微机电技术的成熟和发展，生物芯片和微芯片在脉冲电场领域的应用得到了广泛关注。目前，基于微芯片的脉冲电场技术（microchip pulsed electric field，MPEF）已被应用于细胞融合、细胞捕获[5]、裂解和电转染[6]等生物学领域。因为微芯片具有微米级的电极间距，较传统PEF处理室的间距减少几十倍至上百倍，达到相同的杀菌效果所需电压大幅降低[7]；微芯片的高表面体积比有利于散热。因此，借助微芯片研究脉冲电场杀菌有十分理想的发展空间。近年来，已有研究者将目光投入到MPEF杀菌技术研究中[8]，但仍处于初期平台优化阶段，在前人研究基础上，本课题组研发了一种新型MPEF技术，实现低电压下对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酿酒酵母较好的杀灭效果[9]。

细胞膜不可逆破损和细胞内化合物的泄漏是PEF导致微生物死亡的关键因素[10-11]，此外，脉冲电场引起细胞膜成分的变化也被广泛关注[12-13]。但是，目前关于PEF的致死机理尚没有统一定论，微生物整体基因调控的研究较少。MPEF技术由于微芯片的加入极大地降低了杀菌电压，尽管同属于脉冲电场杀菌，但微处理室是否对微生物有不同的影响仍有待验证。为更好地利用MPEF技术，充分了解其杀菌机理是十分必要的。转录组测序（RNA-Seq）根据基因组的测序信息和注释情况，从整个转录水平上反映细胞中基因表达情况及其调控机制，可用来研究特定生物过程中基因表达的差异[14]。借助该技术，前人已经成功阐明小檗碱对禽源大肠杆菌的抑菌作用[15]、黄芩水煎剂对尿道致病性大肠埃希氏菌的作用机理[16]、酿酒酵母乙酸耐性的分子机制[17]等，但在脉冲电场杀菌方面类似研究较少。

本研究分析MPEF技术对毕赤酵母的致死效果和处理前后基因表达的变化，结合生物信息学方法对差异表达基因进行注释、分类和相关功能分析，探究该技术的杀菌机理，为MPEF技术应用于果汁杀菌提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毕赤酵母（Pichia）为本实验室从蓝莓汁中分离纯化的1 株腐败菌。

YPD肉汤培养基、YPD琼脂培养基 北京奥博星生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒、DNase I、TIANScript cDNA试剂盒、Real Master Mix（SYBR Green）试剂盒 天根生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-30KBS蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；TS-100B恒温摇床 上海捷呈实验仪器有限公司；3H16RI冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；HiSeq2000测序平台 美国Illumina公司；ABI 7500 Fast实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantification-polymerase chain reaction，q-PCR）仪美国应用生物系统公司；方波脉冲电源 上海索宜电子科技有限公司。

实验室规模的连续MPEF处理系统主要由定制的方波脉冲电源和自行设计的微芯片（图1）组成[9]。脉冲宽度设定为0.20 ms，每次处理前后，用75%乙醇溶液清洗通道，然后用无菌水冲洗。

图1 微芯片示意图Fig. 1 Schematic of the microchip

1.3 方法

1.3.1 毕赤酵母的培养

YPD肉汤和琼脂培养基于121 ℃灭菌20 min，将从腐败蓝莓汁中分离出的毕赤酵母菌株接种到50 mL无菌YPD肉汤培养基中，32 ℃、150 r/min摇床培养12 h至对数中后期，重复活化2 代待用，菌液浓度为106～107CFU/mL。对数中后期细胞分裂迅速、生长旺盛，因此该时期细胞对电场的变化更为敏感[9]，选择培养至对数中后期的毕赤酵母细胞进行后续研究更具代表性。

1.3.2 致死和亚致死损伤的测定

通过平板计数法检测MPEF处理后毕赤酵母死亡和亚致死情况。非选择性培养基为YPD琼脂培养基，向该培养基中添加4.5% NaCl溶液作为选择性培养基[18]。通过比较不同电压（100～500 V）和脉冲个数（20～100）下细胞的对数下降值，研究MPEF技术对毕赤酵母的钝化效果。对数下降值（lgS）[19]计算见式（1）：

式中：N0为处理前非选择性或选择性培养基中存活的微生物数/（CFU/mL）；N1为处理后在相同培养基中存活的微生物数/（CFU/mL）。

1.3.3 毕赤酵母总RNA的提取和测序

提取样品总RNA并使用DNase I消化DNA后，用Oligo d（T）磁珠纯化总RNA中的mRNA，向得到的mRNA中加入适量打断试剂高温条件下使其片段化，再以片段后的RNA为模板，合成cDNA，经过磁珠纯化、末端修复、3’末端加碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，文库质控合格后进行测序、分析。

1.3.4 q-PCR验证

选择6 个显著表达的差异基因进行q-PCR分析，引物序列见表1，根据TIANScript cDNA试剂盒说明合成cDNA第1链，采用Real Master Mix（SYBR Green）试剂盒，ABI 7500 FAST q-PCR系统进行实时荧光定量检测，所有实验重复3 次。

表1 q-PCR引物Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR

1.4 数据处理

1.4.1 基因定量

借助RSEM工具进行基因表达定量，通过Paired-end关系、reads长度、质量值等，基于最大期望算法建立最大似然的丰富度模型，结果以Fragment PerKilo Million（FPKM）表示，计算见式（2）：

式中：FPKM为基因A表达量；C为比对到基因A的reads数；L为fragment长度；N为比对到参考基因的总reads数。

1.4.2 差异表达基因

采用edgeR软件包进行差异表达基因的分析，当基因表达量在不同样品间具有差异且统计分析中假阳性率小于0.05，同时差异倍数在2 倍以上时，认为其在2 个不同样品中具有显著差异表达。

1.4.3 差异基因深入挖掘

把所有差异表达基因在基因本体（gene ontology，GO）数据库中进行各个term映射，计算每个term基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集的GO条目，以校正后的P不大于0.05为阈值。通过GO功能显著性富集分析可确定差异表达基因行使的主要生物学功能。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）[20]是有关Pathway的主要公共数据库，通过Pathway显著性富集能确定差异表达基因参与的主要生化代谢途径和信号转导途径。

1.4.4 q-PCR结果计算

根据q-PCR原始检测结果，按照2－ΔΔCt法计算各样品目的基因相对定量结果，见式（3）：

式中：F为目的基因的相对表达量。

上述所有实验重复3 次，借助Origin 9.0软件对致死和亚致死损伤结果进行作图，采用SPSS 16.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 MPEF对毕赤酵母的致死与亚致死效果

图2 电压（a）和脉冲个数（b）对毕赤酵母钝化效果的影响Fig. 2 Logarithmic decline of P. rhodanensis with respect to voltage (a)and pulse number (b)

由图2可知，毕赤酵母在选择性培养基中对数下降值更高，特别是在200 V电压、80 个脉冲条件下，毕赤酵母在选择性培养基中下降了（3.56±0.09）个对数值，而在非选择性培养基中仅下降了（2.81±0.11）个对数值，两者的差值证明了亚致死细胞的存在[21]。Wang Mansheng等[22]研究PEF技术对酿酒酵母的影响，结果表明PEF处理可以导致细胞死亡、亚致死或者无明显损伤。如图2a所示，随着电压的增加，MPEF对微生物的致死效果显著增强（P＜0.05），这与Zhao Wei等[23]的研究结果一致。当电压达到400 V时，毕赤酵母在2 种培养基中的对数下降值无明显差异，说明400 V电压对毕赤酵母有很好的致死效果。此外，毕赤酵母的致死效果随着脉冲个数的增加呈现逐渐增加的趋势，如图2b所示，当脉冲个数为80时，亚致死细胞数接近0，此后，持续增加脉冲个数，致死效果没有显著变化。因此，MPEF在400 V电压、80 个脉冲条件下，可以很好地杀灭毕赤酵母。

2.2 毕赤酵母差异表达基因的一般分析

通过对MPEF处理前后毕赤酵母转录组测序的数据进行标准化处理，对所有基因的表达量绘制散点图，结果如图3所示，纵坐标为差异显著性，横坐标为在不同条件下基因表达变化倍数，灰色为差异变化不显著基因，共计16 610 个，红色和蓝色为差异变化显著基因，共计794 个，其中上调基因361 个，下调基因433 个。对差异基因的表达量进行log2处理，然后根据处理后的表达量进行样品间的聚类分析（图4）。

图4 差异基因的聚类图Fig. 4 Cluster diagram of differentially expressed genes

由表2可知，差异基因的GO功能富集主要集中在细胞成分（6 706 条）、分子功能（4 854 条）和生物过程（15 860 条）3 个方面。参与三羧酸循环和小亚甲基RNA、丙酮酸转运、核仁、大亚基前体、膜的完整性、异柠檬酸脱氢酶活性、ATP酶活性、跨膜转运蛋白活性、核酸酶活性等多种功能的基因进行极显著差异表达。对MPEF处理前后毕赤酵母差异表达基因进行KEGG显著性富集分析（表2），由于电场对微生物的作用，导致三羧酸循环、代谢和生物合成等发生显著性变化。

表2 显著富集的9 条代谢通路Table 2 9 Metabolic pathways significantly enriching differentially expressed genes

2.3 q-PCR验证实验结果

根据上述GO和KEEG富集分析，选取各条目和代谢通路中显著变化，且表达量较多的6 个差异基因，它们主要参与糖代谢、RNA代谢和氨基酸代谢，利用q-PCR对MPEF处理前后的基因差异表达倍数（MPEF组/对照组）进行分析，结果如表3所示，虽然转录组测序结果和q-PCR分析结果表达倍数有差异，但差异表达的变化趋势基本一致，说明转录组测序数据的可靠性，表达倍数的差异可能是由于仪器、算法等不同造成的。

表3 差异表达基因q-PCR验证结果Table 3 q-PCR Validation of differentially expressed genes

2.4 基于转录组数据的MPEF致死毕赤酵母机制分析

2.4.1 MPEF对参与细胞结构基因表达的影响

如表4所示，通过分析MPEF处理前后毕赤酵母的基因差异表达，发现参与生物膜的形成和成分等基因出现显著差异。控制生物膜形成的基因显著下调，说明膜的完整性遭到破坏[24]。MPEF处理组中编码质膜成分的基因中出现2 个显著上调，8 个显著下调；编码内质网膜成分的基因中出现了2 个显著下调。生物膜成分的改变可能造成膜流动性和通透性的变化[25]，Liu Zhiwei等[26]的研究结果表明PEF处理引起大肠杆菌细胞膜成分的改变，进而对膜的流动性造成影响，导致细胞死亡。Ferrario等[27]利用流式细胞仪结合PI染色技术验证了PEF对微生物的致死效果与细胞膜的损伤有关。此外，调节细胞壁形成及功能等基因出现显著变化，说明MPEF处理对细胞壁产生了影响；由MPEF处理后毕赤酵母细胞中内质网合成与功能的下降，推测糖类、脂质的合成及蛋白质的运输受到了影响[28]；MPEF处理后，细胞器裂变加剧，与内质网、线粒体等形成和功能有关的基因均发生显著变化，2 个调控细胞骨架的差异基因显著下调。因此，MPEF处理导致细胞膜等生物膜受损，细胞壁、细胞器等形成和功能发生变化，细胞成分改变，上述变化是MPEF致死细胞的主要原因之一。

表4 部分与细胞结构相关的差异基因转录水平Table 4 Transcription levels of differentially expression genes related to cell structure

2.4.2 MPEF对参与DNA、RNA和蛋白质合成代谢基因表达的影响

由表5可知，与对照组相比，MPEF组中核苷酸的合成、调节均显著下调，与核糖核苷结合相关基因出现显著变化，DNA复制和代谢相关基因均不同程度地下调，推测DNA的复制减缓或部分被抑制；DNA损伤上调，且重组修复、双链断裂修复等均显著下调，DNA修复出现1 个上调基因，4 个下调基因，说明电场造成DNA损伤，破坏其自身修复能力。与核仁相关基因、控制核糖体生物合成的基因显著下调，控制rRNA、mRNA、tRNA的生物过程、结合过程和代谢过程的基因均不同程度地下调；大亚基和小亚基的生物合成显著下调；RNA和蛋白质代谢紊乱；调节蛋白质定位至细胞核和细胞器，控制基因表达和蛋白质翻译、修饰、运输等基因显著下调。上述变化表明MPEF处理造成毕赤酵母基因损伤[29]，同时对RNA和蛋白质的生物合成和代谢造成显著影响，核苷酸水平的降低，蛋白质合成[30]和功能受限[31]是电场造成毕赤酵母死亡的原因之一。

表5 部分与DNA、RNA和蛋白质合成代谢相关的差异基因转录水平Table 5 Transcription levels of differentially expressed genes related to synthesis and metabolism of DNA, RNA and protein

2.4.3 MPEF处理对酶活性相关基因表达的影响

表6 部分与酶活性相关的差异基因转录水平Table 6 Transcription levels of differentially expressed gene related to enzymatic activities

通过比较对照组和MPEF组酶活性的变化，发现MPEF处理对毕赤酵母体内酶活性产生显著影响，部分酶活性相关的基因转录水平变化如表6所示。MPEF处理导致半胱天冬蛋白酶被激活，该酶可以直接破坏细胞结构，调节蛋白丧失功能，比如阻断DNA复制、造成DNA和核结构的损伤、拆散细胞骨架[32]等，这与2.4.2节结果一致。蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性调节的下降意味着蛋白质功能受损[33]，核糖核酸酶、RNA聚合酶活性均下调；此外，辅酶、ATP合成酶、丙酮酸脱羧酶等参与细胞代谢的酶均出现显著变化，说明相应代谢反应也受到了影响；控制氧化还原酶活性的基因出现1 个显著上调，3 个显著下调；酶的催化活性也受到显著影响。因此，MPEF处理对酶产生显著影响，酶活性的变化直接或间接影响了生物大分子的功能、代谢反应的发生[34]等，说明相应细胞进程改变，这也是引起细胞死亡的原因。

2.4.4 MPEF处理对生物合成相关基因表达的影响

表7 部分与生物合成相关的差异基因转录水平Table 7 Transcription levels of differentially expressed genes related to biosynthesis

从表7可以看出，MPEF处理破坏正常的生物合成调控和细胞体内平衡。谷氨酸生物合成的变化表明蛋白代谢受到影响[35]，控制肌动蛋白丝、核黄素、ATP、脂质、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸合成的基因显著下调，肌动蛋白丝在细胞体内具有支撑和信息传导作用[36]，MPEF处理使其合成受阻，导致细胞结构受损；MPEF组中的血红素、脂蛋白以及卵磷脂等生物合成也发生了显著变化。此外，核碱基的生物合成中出现1 个显著上调基因，3 个显著下调基因，说明碱基配对出现异常，可能引起蛋白翻译错误[37]，影响毕赤酵母的正常生长。MPEF处理对细胞体内大分子物质的生物合成有一定的影响，破坏体内平衡过程，这也是引起细胞死亡的原因。

2.4.5 MPEF处理对跨膜运输能力基因表达的影响

由表8可知，离子跨膜转运蛋白活性受电场影响较大，而控制ATP偶联离子跨膜转运蛋白活性的4 个基因中有3 个显著下调，导致离子跨膜运输能力发生变化。钠离子跨膜转运蛋白活性的下调说明MPEF影响钠离子的正常转运；铜离子作为胞内酶所必需的组分，其转运能力的下降对细胞正常生命活动有显著影响[38]。此外，MPEF处理对氨基酸、多胺、有机酸、丙酮酸、糖等的转运具有显著影响，这些有机化合物跨膜转运能力的变化说明酵母细胞体内代谢反应、生命活动发生改变，电场显著抑制了核酸的运输和跨膜运输调节，使毕赤酵母体内跨膜信号转导紊乱，进一步影响细胞的正常生理功能，导致酵母细胞死亡。

表8 部分与运输能力相关的差异基因转录水平Table 8 Transcription levels of differentially expressed genes related to transport capacity

2.4.6 MPEF处理对代谢过程相关基因表达的影响

表9 部分与代谢过程相关的差异基因转录水平Table 9 Transcription levels of differentially expressed genes related to metabolic processes

如表9所示，MPEF作用于毕赤酵母，细胞碳水化合物代谢过程出现29 个上调基因，12 个下调基因；电场对氨基酸的代谢也有显著影响，谷氨酸合成代谢出现2 个显著上调基因，4 个显著下调基因。此外，MPEF处理对细胞内脂质、有机酸、核苷酸、核黄素、芳香化合物、维生素等代谢均有显著影响，说明MPEF处理不仅影响生命活动所必需的初级代谢过程，对次级代谢过程也有一定影响。电场作用于酵母细胞后，调节其碳水化合物代谢、糖酵解等过程的差异基因显著变化，控制ATP代谢过程的2 个差异基因全部显著下调。代谢调节水平的下降与酶量和酶活性的降低紧密联系[39]，上述结果也说明了MPEF处理影响mRNA和蛋白的翻译以及酶活性。代谢调节的减弱增加了细胞新陈代谢活动的能耗[40]。

分解代谢是释放能量的过程，MPEF组与对照组相比，控制碳水化合物分解过程的差异基因中10 个显著上调，5 个显著下调；参与乙醛酸分解代谢、核苷酸分解代谢的差异基因全部下调，参与芳香化合物和氮化合物分解代谢过程的差异基因中分别有4 个显著上调，8 个显著下调；参与三羧酸循环的所有差异基因全部显著上调，说明MPEF处理对毕赤酵母细胞的分解代谢能力有显著影响，对部分分解代谢有抑制作用，对部分分解代谢有激活作用，激活可能是细胞为了抵御电场不利影响而出现的应激反应。因此，MPEF处理使得毕赤酵母细胞内代谢机制紊乱[41]，破坏其自动调节能力，无法适应电场环境，最终导致细胞死亡。

3 结 论

MPEF技术对毕赤酵母有很好的致死效果，在400 V电压、80 个脉冲条件下，毕赤酵母下降了（6.39±0.17）个对数值。MPEF处理对细胞的损伤较为严重，包括细胞膜在内的生物膜是其作用的一个关键位点，膜完整性遭到破坏；细胞壁的保护作用减弱；细胞器和细胞骨架受损。细胞组分的改变导致相应功能的变化，最为明显的是核仁、核糖体的生物合成和功能被显著抑制，这是引起细胞死亡的主要原因。此外，MPEF处理造成基因损伤、碱基配对异常、蛋白质转录翻译受阻；蛋白功能被部分抑制，酶活性、生物合成及跨膜转运能力发生改变，最终造成毕赤酵母体内代谢紊乱；自由基增多，而抗氧化酶系下调表达导致自由基清除系统被减弱，最终引起毕赤酵母死亡。电场对线粒体产生十分显著的影响，线粒体受损可能导致细胞色素C的释放，同时半胱天冬蛋白酶显著上调，形成酵母细胞凋亡小体，从而诱导毕赤酵母凋亡的发生，该过程是MPEF导致基因调控变化引起的。

MPEF处理使得控制毕赤酵母细胞生长发育、繁殖、呼吸和信号转导的基因发生显著变化，多生物过程调控、细胞内分子定位及调节等显著下降。MPEF对微生物的钝化机制是十分复杂的，基因损伤和调控的变化，细胞结构的破坏，酶活性的改变是减弱生物合成能力和引发代谢紊乱的前提，是导致细胞死亡的主要原因。