一起蜡样芽孢杆菌引起食物中毒的实验室检测

王伟栋 王丽娟 刘晓琳 王慧 曲剑英

蜡样芽胞杆菌为条件致病菌，能产生耐热和不耐热两种毒素，前者为致吐肠毒素，后者为致泻肠毒素。该菌污染产毒的食品一般无腐败变质的异味，不易被发觉，当食入食品含蜡样芽胞杆菌达105cfu/g以上时，可引起食物中毒。2012年5月25日，青岛某中学部分学生因食用学校食堂提供的午餐（盒饭），多名学生出现呕吐、腹泻、腹痛、发热等症状，疑似食物中毒。流调人员采集了部分病人的呕吐物、便样和剩余食物，于21：30- 24：00将样品带回到实验室进行检验。

流行病学调查

2012年5月25日中午，本市某中学学生食用学校食堂11：50开始分发的盒饭午餐，食物为米饭、红烧茄子、烤鸡块、虾皮萝卜粉丝、熟玉米和小米稀饭等，13时起部分学生开始出现腹部不适，16时许部分学生陆续出现呕吐、腹痛、恶心等症状，分别前往附近医院就诊。临床症状以上腹部阵发性绞痛，最先出现的病例以呕吐为主，呕吐严重者12次/天，轻者1次/天，一般均在6～7次/天，后续病例以呕吐加腹泻，腹泻一般1- 3次/天的急性胃肠炎症状为主，经对症治疗大部分患病学生于当日康复，无死亡病例。

实验室检测

试剂和材料。（1）培养基 本次检验所需的各种培养基和蜡样芽胞杆菌成套生化鉴定管（SHBG09）由青岛海博生物技术有限公司提供，均在有效使用期内。（2）荧光PCR试剂 蜡样芽孢杆菌核酸测定试剂盒由上海之江生物科技股份有限公司提供，在有效使用期内。（3）仪器 MARK2 0805- 461智能厌氧培养系统、FIuoCycIe实时荧光定量PCR仪、TGL-16B高速台式离心机、恒温金属浴等。

样品采集。（1）食品样品14份：留样的盒饭一份（米饭、红烧茄子、虾皮萝卜丝、烤鸡腿快、蒸玉米棒）；李锦记草菇老抽1份、六合香无盐味精1份、中盐碘盐1份、白梅砂糖1份、口福调和油1份、生茄子1份、生鸡腿1份、生玉米1份、温开饮用水1份。（2）患者呕吐物13份（样品标记6#—18#）；（3）患者便样5份（样品标记1#—5#）。（4）餐具无菌生理盐水棉拭子8份。以上样品均为无菌采样，送实验室检验。

检验项目。根据流行病学调查要求检测：蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌；温开饮用水加做菌落总数和总大肠菌群；餐具仅检测大肠菌群。

检验方法。参照国家标准W S /T 82-1996、WS/T13- 1996、WS/T9- 1996和GB/ T4789.5，6，7，GB4789.10- 2003、GB/T 5750.12- 2006、GB14934- 1994。

检验程序。（1）呕吐物、便样检测：①直接分离：接种MYP平板、沙门氏菌显色平板、XLD平板、EMB平板、弧菌显色平板、B- P平板和营养琼脂平板36℃培养24h。②增菌分离：分别放入10ml的肉浸液肉汤、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、GN增菌液、3%碱性蛋白胨水和7.5%NaCl肉汤增菌液中。37℃培养18小时，志贺氏菌增菌肉汤41.5℃厌氧培养18小时。经培养后分离到相应选择分离平板，37℃培养20小时，挑取可疑菌落进行鉴定。（2）食品和温开饮用水检测：按照食品安全国家标准、食品卫生微生物学检验和GB/T5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标进行相应检测。（3）餐具大肠菌群采用发酵法检测。（4）荧光PCR试剂盒按说明书使用。蜡样芽孢杆菌呕吐毒素基因cesB为检测靶标的，结果仅供参考。

结果。（1）食品样品14份经增菌液，分离的选择平板上均未见可疑菌落生长，所检项目均为未检出。（2）患者呕吐物13份增菌液和直接分离选择平板仅9#和14#见蜡样芽胞杆菌可疑菌落生长，涂片镜检为G+大杆菌，芽胞呈卵圆形，不突出菌体，位于菌体的中央或稍偏一端。经生化鉴定为蜡样芽胞杆菌，生化分型为5型（详细结果见表）。呕吐毒素基因2株均为阳性。其余选择平板上均未见可疑菌落生长，所检项目均为未检出。（3）便样5份增菌液和直接分离平板，均检出大肠埃希菌，经鉴定均为非致病性大肠埃希菌，其余选择平板可疑菌落均未见生长，所检项目均为未检出。（4）温开饮用水 菌落总数3800CFU/mL和總大肠菌群<2MPN/100mL。（5）餐具样品 大肠菌群均为阳性结果。

讨论

1.我国引发蜡样芽胞杆菌食物中毒的食品多为食用了加热不彻底或保存不当的剩米饭所致，在发生本菌食物中毒时，中毒食品大多无腐败变质现象，除米饭有时微有发粘、人口不爽或稍带异味外，大多数食品的感官性状正常。引起本次食物中毒食品25日中午食堂工作人员使用3板24日中午的剩余米饭，剩余米饭存放于打开门的蒸箱内，未冷藏保存，剩余米饭在室温自然条件下存放超过18h，为蜡样芽胞杆菌的繁殖提供了条件。

2.食物中毒检测的采样是关键，影响细菌性食物中毒检验结果因素有盲目性、缺乏及时性、代表性、典型性、完整性等。5月25日13：30时个别学生开始出现腹部不适，在16：00时部分学生陆续出现发病症状并前往医院就诊，而且在发病学生持续增加的情况下，直至当晚18：00才报告情况，导致事故处置迟缓滞后，食物中毒采集到病人呕吐物和便样缺乏及时性和代表性。由于导致食物中毒的盒饭通过分餐、装箱、运转、传送、分发及学生领取餐盒的过程很随机，无法定位盛有剩米饭的餐盒发给那一部分学生。

3.肠毒素检测。蜡样芽胞杆菌生化性状与苏云金芽孢杆菌极为相似，虽可藉苏云金芽孢杆菌细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴定，但试验所需时间较长。本次利用荧光PCR法检测蜡样芽孢杆菌呕吐毒素基因cesB，检查分离菌株的产毒性来协助诊断，结果比较理想。目前利用蜡样芽孢杆菌毒素基因进行快速的实验室检测方法较多，由于受所用仪器、试剂及毒素基因的性质影响，建立一种简便可靠的检测方法作为快速诊断手段，仍待研究解决。