改性纳米金富集-毛细管电泳电化学发光法测定水产品中4种氟喹诺酮类药物残留

陈宗保，王 星，尹月春，陈国南

(1.上饶师范学院 化学与环境科学学院 江西省高等学校应用有机化学重点实验室，江西 上饶 334001；2.福州大学 化学学院 食品安全分析与检测教育部重点实验室，福建 福州 350116)

氟喹诺酮类药物(FQs)具有抗菌谱广、杀菌力强、使用方便,以及与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用等特点，因此被广泛应用于兽禽疾病的防治[1]。但此类药物的不当和过量使用所导致的药物残留会危害人体健康，也会使致病菌产生耐药性，从而间接危害人类健康。同时，氟喹诺酮类药物也是水产品中一类重要的药物残留污染物[2]。因此，对该类药物的检测具有重要意义。目前，检测氟喹诺酮类药残的方法有微生物法、酶联免疫法(ELISA)[3]、毛细管电泳法(CE)[4]、高效液相色谱法(HPLC)[5-7]、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[8-9]、电化学发光法(ECL)[10]。其中，微生物法及酶联免疫法操作简单、快速，但灵敏度不高，高效液相色谱及其联用技术检测准确、可靠，但检测仪器昂贵，电化学发光法具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于控制等特点。毛细管电泳-电化学发光联用(CE-ECL)技术则结合了毛细管电泳的高效分离和电化学发光的高灵敏度的优点，成为一种快速、经济、简便的分离分析技术[11-12]。目前，利用CE-ECL联用技术检测氟喹诺酮类药物的报道甚少[13-14]。

本文利用3-巯基-1-丙胺改性纳米金粒子，探索新型富集及CE分离技术。通过优化实验条件，建立了一种基于改性纳米金粒子富集结合CE-ECL技术对4种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星)的检测方法。该方法具有高效、快速、富集倍数高等优点，能够满足快速测定痕量氟喹诺酮类药物的分析要求。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(EN)、氧氟沙星(OF)、诺氟沙星(NOR)标准品(纯度均大于98%,上海生工生物工程技术服务有限公司)；六水合三联吡啶氯化钌[Ru(bpy)3Cl2·6H2O]、Tween-80(Aladdin试剂公司)；二硫苏糖醇(DTT)、3-巯基-1-丙胺(纯度为98%，Adamas试剂公司)；Span-80、Triton X-100(分析纯，北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；其它试剂为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

MPI-A型毛细管电泳-电化学发光检测仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司)；有效长度为67 cm、内径为50 μm未涂层熔融石英毛细管(河北永年锐沣色谱器件有限公司)；TDZ4-WS型离心机(湖南赛特湘仪厂)；PHS-3C型精密酸度计(上海大普仪器有限公司)；KQ-100型超声波清洁器(昆山市超声仪器有限公司)，Milli-Q超纯水系统(Millipore，Bedford)。

1.2 实验方法

1.2.1毛细管的活化有效长度为67 cm的毛细管(75 μm×65 cm)分别经0.1 mol/L盐酸、水、0.5 mol/L氢氧化钠、PBS缓冲溶液各冲洗30 min。每次进样间隔需用电泳缓冲液清洗3 min，每进样5次，依次分别用水、0.5 mol/L氢氧化钠、水和电泳缓冲液清洗10 min。使用前所有溶液均用0.22 μm滤膜进行过滤，然后经超声器振荡以除去溶液中的微小气泡。

1.2.2纳米金的合成及修饰按照Frens的方法[15]合成纳米金液：将50.0 mL 2.5×10-4mol/L的 HAuCl4水溶液边搅拌边加热至沸后，一次性加入1.75 mL 10.0 g/L的柠檬酸钠溶液形成酒红色，表明得到金纳米粒子，继续搅拌30 min，放置冷却至室温。准确移取1.0 mL AuNPs溶液，加入适量3-巯基-1-丙胺溶液，过夜后，离心洗涤1～2次，得到改性金纳米沉淀，随后加入25 mmol/L pH 4.0的PBS缓冲溶液，得到改性的纳米金溶液。

1.2.3目标物的富集及分析分别取4种5.0×10-3mol/L 的FQs标准储备液400 μL于离心管中，用25 mmol/L pH 4.0的PBS缓冲液稀释至4 mL FQs溶液。将500 μL FQs溶液与500 μL Au溶液混合，其混合液室温放置1 h后，离心洗涤得沉淀，加入10 μL新制的1 mol/L DTT释放剂，再悬浮以充分释放富集的目标物，室温放置20 min后离心洗涤，去除沉淀物，所得上清液上机分析。

1.2.4样品处理准确称取匀浆成糊状的鳗鱼鱼肉10.0 g，加入5.0 g无水硫酸钠，每次加15.0 mL乙腈，分别提取3次，合并提取液，离心，取上清液至圆底烧瓶。向烧瓶中加入6.0 mL正丙醇，旋干，加入2.0 mL乙腈-水(40∶60)混合液，再加入2.0 mL乙腈饱和正己烷溶液，振荡均匀，离心分层，取下层液体，用0.22 μm微孔滤膜过滤，待富集后测定。

2 结果与讨论

2.1 富集原理及倍数

纳米金粒子具有小粒径、大比表面积，很高的界面活性等特点，而氟喹诺酮类药物均具有羧基(—COOH)的特殊结构。为使纳米金能较好地富集目标物，实验采用3-巯基-1-丙胺对纳米金进行表面修饰，使其带上氨基(—NH2)，在酸性条件下，修饰有氨基的AuNPs可与带有羧基的FQs药物进行多位点的氢键作用，使之富集聚沉。随着DTT释放剂的加入，可使富集的目标物游离出来，从而实现目标物的分离检测，其示意图如图1所示。

图1 改性纳米金富集恩诺沙星的原理图

2.2 方法的可行性

2.3 ECL检测条件的选择

图2 缓冲液pH值对电化学发光强度的影响

图3 分离电压对分离的影响

图4 缓冲液浓度对分离的影响

图5 进样电压对发光强度及分离度的影响

2.4 电泳分离条件的选择

2.4.1分离电压的优化在毛细管电泳中进行高通量分析检测时，分离电压对分析物的检测时效及分离效果有较大影响。在实际分析中，常采用较高的分离电压以加快分析速度并提高分离度，但过高的电压会对多组分的分离造成不良影响。因此，实验考察了10～20 kV范围内不同分离电压对分离度及电流值的影响(图3)。结果表明，随着分离电压的增大，电流和分离度(RS)均呈上升趋势，并在分离电压为14 kV和16 kV时，4种分析物可实现有效分离，且分离电压为16 kV时，分离度更高，电流值更大。继续增大分离电压时，分离度下降，而电流信号虽增加，但基线噪声信号增强，不利于分离。故实验选择最佳分离电压为16 kV。

2.4.2缓冲液浓度的优化缓冲溶液的浓度由于会影响缓冲体系的离子强度，从而改变溶质与管壁之间和被分离组分之间的相互作用，故其影响不可忽视。实验考察了PBS溶液浓度分别为15、20、25、30、35 mmol/L时对电流响应值和分离效果的影响(见图4)。实验发现随着电泳缓冲液浓度的逐渐增大，电流值平稳增加，而分离效果则呈倒“U”型变化，当电泳缓冲溶液浓度为20～30 mmol/L时基线平稳，分离效果较好，但当电泳缓冲溶液浓度大于25 mmol/L时，其基线噪声信号明显增强，电泳图谱峰出现峰刺、展宽现象，故实验选择PBS缓冲液的最佳浓度为25 mmol/L。

2.4.3进样时间及电压的优化实验CE-ECL仪器装置采用可编程的高压电源(0～20 kV)电动进样模式，研究表明，进样量决定性地影响着分离度及检测灵敏度。考虑到延长进样时间时，进样量增多，造成组分扩散，峰形变宽，分离效率降低，因此实验固定进样时间为10 s，考察了不同电动进样电压(6、8、10、12、14、16 kV)对电化学发光强度及分离效率的影响(图5)。实验表明，随着进样电压的逐渐升高，电化学发光信号增强程度由快到慢，而分离度则相反，在进样电压由低到高的变化过程中，分离度逐渐下降，大于12 kV时，分离度RS小于1.5,表明无法完全分离。故在控制一定进样量(进样时间10 s)时,实验选择12 kV为最佳进样电压。

图6 4种药物在最优条件下的电泳分离谱图

2.5 富集倍数

在缓冲溶液pH=3.0～4.0，AuNPs用量1 mL时，将200 μL 0.5 mmol/L 3-巯基-1-丙胺修饰剂与0.2 mmol/L Triton X-100改性剂用于富集样品浓度为1.0×10-5mol/L的混合标准样品，平行测定3次。结果表明，CIP、EN、OF、NOR 4种分析物的平均富集倍数分别为104、127、111和106倍。表明该方法可以提高的灵敏度。

2.6 线性范围、检出限及方法精密度

以乙腈与水(3∶7)混合液为稀释剂，分别将CIP、EN、OF和NOR 4种标准储备液稀释成一系列浓度(0.05～10 μmol/L)工作液。在最佳条件下富集后，依次进行分析检测。以峰高(y)对浓度(x，μmol/L)作图，分别得到CIP、EN、OF和NOR的线性方程、相关系数、线性范围及检出限(LOD)，结果如表1所示。4种分析物在一定浓度范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.992，以信噪比S/N≥3的浓度计算其检出限(LOD),各分析物的LOD均不大于0.05 μmol/L。在最优条件下，同1天内连续6次对不同浓度水平的加标鳗鱼样品进行CE-ECL分析，依据CIP、EN、OF、NOR的峰高及保留时间计算日内平均相对标准偏差(RSD)，4种分析物的峰高RSD均不大于8.3%，保留时间RSD均小于7.2%。

表1 CIP、EN、OF、NOR的线性范围、线性方程、相关系数(r)及LODsTable 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients(r) and LODs of CIP,EN,OF and NOR

2.7 样品分析及回收率实验

鳗鱼样品经“1.2.4”方法处理后，在最优条件下，采用改性纳米金预富集方法对加标后的鳗鱼提取液进行分析，在实际样品中未检测出4种分析物。在实际样品中直接添加两种水平(20、50 μmol/L)的标准溶液，回收率结果如表2所示。结果表明4种分析物的样品回收率为94.5%～112%，RSD均不大于6.3%。因此，该方法可用于实际样品中4种药物残留的同时检测。

表2 鳗鱼样品的回收实验(n=3)Table 2 Recovery test of the spiked eel sample(n=3)

3 结 论

本文采用改性纳米金颗粒对4种FQs药物进行富集，结合CE-ECL检测技术，建立了一种高灵敏分析检测FQs药物的方法。对富集与分离条件进行优化，在优化条件下，该方法的检出限可达0.02 μmol/L，应用于实际鳗鱼样品的检测，效果良好。