气相色谱-串联质谱法检测化妆品中25种防腐剂

孙 晶, 谭 力, 曹 玲*, 王伟国, 冯有龙, 杭太俊

(1. 江苏省食品药品监督检验研究院, 江苏 南京 210019; 2. 中国药科大学药学院, 江苏 南京 210008)

为满足我国化妆品监管实际的需要,结合行业发展和科学认识的提高,2015年国家食品药品监督管理总局组织完成了对《化妆品卫生规范》(2007年版,简称《卫生规范》)的修订工作,编制了《化妆品安全技术规范》(2015年版,简称《技术规范》, 2016年12月1日施行)。该《技术规范》定义防腐剂为以抑制微生物在化妆品中的生长为目的而在化妆品中加入的物质。一方面,防腐剂为化妆品中限用物质,过量或不适当使用会出现不良反应[1],如过量使用甲基异噻唑啉酮(MIT)会引起接触性皮炎[2];对羟基苯甲酸类防腐剂随着碳链长度的增加,雌激素属性会随之增加[2]。另一方面,国内出现“无防腐剂添加”热潮,实为不良媒体和商家夸大防腐剂的副作用,加入一些没有列入防腐剂准用清单但具有防腐活性的物质[2,3],误导消费者。

必须明确化妆品确实需要具有防腐效能的物质存在,但应加强监管,《技术规范》在编排时通过与全球主要国家和地区化妆品相关法规标准进行比对分析,列出了允许使用的防腐剂准用组分清单,细化和调整了化妆品中防腐剂的禁限用组分要求[4],从原《卫生规范》中收录的56种准用防腐剂修订减少至51种,删除了氯乙酰胺、聚季铵盐-15、乌洛托品等5种防腐剂[4];但是《技术规范》所列出的防腐剂测定方法却不能满足防腐剂监管的需要,这在近几年国家风险监测防腐剂的测定中逐渐暴露。如实际测定的防腐剂种类与配方标签不符,可能是因为配方添加量低于方法检出限,或方法专属性差,无法排除基质干扰,易造成误判[5]。《技术规范》中“ 防腐剂检测方法”项下共收录11种防腐剂的检测方法(共能测定27种防腐剂)。但尚有许多配方中有使用和标注但《技术规范》未收载检验方法的情况。它们多为高效液相色谱法,个别为气相色谱法,由于大多数防腐剂相对分子质量小于200,且共轭体系简单,紫外光谱特征不明显,故HPLC-UV的专属性和灵敏度均较差;仅有苯甲醇和苯甲酸相关方法项下收录了气相色谱-质谱联用法，用于GC和LC测定结果为阳性时的验证方法。为加强监管效力,填补监管空白,有必要建立更广泛、更专属、更灵敏、高通量的防腐剂测定方法。目前文献报道的化妆品中防腐剂的测定方法主要有气相色谱法[6]、气相色谱-质谱联用法[7,8]、液相色谱法[9,10]、液相色谱-质谱联用法[11,12]和毛细管电泳法[13,14]等。

本文参考《技术规范》收载方法，即日常监管覆盖的防腐剂种类和准用防腐剂目录,对市面上常用防腐剂进行调研选择,并加入部分具有防腐效能的物质,建立了一种灵敏度高、专属性良好的气相色谱-串联质谱的测定方法,可以同时测定并确证25种常见防腐类物质。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 7890/7000B气相色谱-串联质谱仪、0.22 μm有机相滤膜(美国Agilent公司); XP6百万分之一分析天平、十万分一天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司);万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司); KQ_300型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,超声频率:40 KHz;超声功率:300 W); ST 16R高速离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司); Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司)。

甲醇为色谱纯,由德国Merck公司提供;无水硫酸钠、L(+)-抗坏血酸为分析纯,均由国药集团化学试剂有限公司提供。105批供试化妆品均为市售样品。

25种防腐剂对照品的信息见表1,其中苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯、对羟基苯甲酸异丙酯、脱氢乙酸购自上海安谱实验科技股份有限公司,1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因(DMDMH)购自山东西亚化学股份有限公司,2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚购自中国食品药品检定研究院,其余防腐剂均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;内标物质(IS):苯酚(批号31016,纯度99.9%)、2-辛醇(批号94900,纯度98.0%)和七氯(批号118148,纯度99.0%)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 标准溶液的配制

混合标准储备液:取苯甲醇、苯氧乙醇、苯氧异丙醇对照品各约80 mg,甲基异噻唑啉酮、甲基氯异噻唑啉酮、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)对照品各约20 mg,其他对照品各约40 mg,置于同一100 mL棕色量瓶中,加入0.1 mg/mL L(+)-抗坏血酸甲醇溶液适量,溶解并稀释至刻度,混匀。

表 1 25种防腐剂的试药信息和使用限度Table 1 Compound information and operation limits of the 25 preservatives

1) calculated on the basis of its acid; 2) total content of benzoate≤0.5%; 3) total content of parabens≤0.8%; /: no provision in the regulation.

混合内标溶液:取3种内标物质各约4 mg,置于10 mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,混匀。

1.3 样品前处理

取混匀的化妆品试样约0.2 g(带有载体的面膜,去除载体后混匀),精密称定,置于具塞离心管中,加入混合内标溶液100 μL,再加入0.1 mg/mL L(+)-抗坏血酸甲醇溶液10 mL,涡旋30 s,再加入无水氯化钠约0.50 g,超声提取20 min,振摇混匀,以5 000 r/min离心5 min,上清液经0.22 μm滤膜过滤,取续滤液作为待测溶液。

1.4 分析条件

HP-5MS气相色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度:250 ℃;分流比10∶1;载气:He;载气流速:1.0 mL/min。程序升温:初始温度为60 ℃,保持2 min,以30 ℃/min的速率升温至120 ℃,保持4 min,再以20 ℃/min的速率升温至160 ℃,保持8 min,最后再以45 ℃/min的速率升温至280 ℃,保持3.5 min。进样体积:1.0 μL。

电离源：EI源;离子源温度：230 ℃;传输线温度：250 ℃;电子能量：70 eV;溶剂延迟时间：4 min;选择反应监测模式(MRM)。其他参数见表2。

表 2 25种防腐剂的保留时间(RT)、离子对和丰度比Table 2 Retention times (RTs), ion pairs and abundance ratios of the 25 preservatives

表 2 (续)Table 2 (Continued)

2 结果与讨论

2.1 检测条件的优化

2.1.1进样口温度的优化

考察进样口温度分别为200、220、240、260和280 ℃时各目标化合物的响应情况。结果发现,针对苯甲酸和脱氢乙酸,当进样口温度为200 ℃时,响应较低,当进样口温度升至240 ℃时,响应和峰形明显升高和改善,继续升温,无明显改善。其他物质在此范围内受进样口温度影响不大。因此实验最终选择250 ℃。

2.1.2内标物质的选择

内标法测定可以显著提高进样精密度,在一定程度上消除样品提取过程和质谱基质效应带来的误差。实验初期，在10余种直链烷醇中选择了出峰时间合适的正庚醇、正癸醇和正十六醇作为内标物质,虽然实验中测定的105批化妆品中均未检出这些直链烷醇,但该类物质可能存在于化妆品香精中,为防止干扰,最终根据保留时间和化妆品中存在的可能性,选择2-辛醇、苯酚和七氯作为内标物质,又根据回收率测定结果,选择使回收率最接近100%的物质作为对应目标化合物的内标。苯酚作为苯甲醇、MIT、苯氧乙醇和MCIT的内标;2-辛醇作为苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯氧异丙醇、DMDMH、脱氢乙酸、4-羟基苯甲酸甲酯、BHA和BHT的内标;七氯作为其他物质的内标。

2.1.3其他检测条件的优化

对程序升温条件进行了优化,实现了25种防腐剂和3种内标物质的有效分离(见图1)。另外,实验还对各个化合物的分析时间段(segment)和驻留时间(dwell time)进行了优化,以保证其良好的峰形和灵敏度。

2.2 提取条件的选择和优化

由表1可以看出,化妆品中防腐剂的允许加入量差异较大,对于安全性较低、响应较差的防腐剂，如甲基氯异噻唑啉酮,需要加大取样量或进行样品浓缩；对于限量较高的防腐剂，如苯氧乙醇和苯甲醇,需要进一步稀释样品。由于25种目标防腐剂极性相差较大,因此没有进行固相萃取的尝试。实验初期尝试了氮气吹干和减压离心浓缩的方式处理供试品,测定结果表明苯甲醇、苯氧乙醇、苯氧异丙醇等物质的回收率显著降低,可能与此类物质挥发性高有关,故最终选择了直接溶剂提取的方式。为了兼顾各防腐剂的溶解度和与高效液相色谱法(外标定量法)的兼容性,实验最终选择甲醇为提取溶剂;为了保护气相色谱柱,加入无水硫酸钠脱水步骤;为

图 1 25种防腐剂和3种内标的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion chromatogram of the 25 preservatives and three internal standardsPeaks 1-25 and IS 1-3 were the same as that in Table 2.

了消除样品和试剂不溶物对终浓度的影响,没有采用定容的方式,而是采用精密加入10.00 mL的甲醇提取。

实验发现，随着超声时间的延长,抗氧剂(BHA、BHT、TBHQ和BHQ)、IPBC和对羟基苯甲酸酯类的回收率均有一定程度的下降,推测与温度上升,物质加速氧化相关,故向甲醇中加入0.1 mg/mL的L(+)-抗坏血酸作为抗氧剂。根据总离子流色谱图基线漂移情况,将溶剂延迟时间推迟至4 min。经验证,加入L(+)-抗坏血酸后样品的回收率满足测定要求。

2.3 方法学考察

2.3.1线性范围、检出限和定量限

在最优测定条件和提取条件下,对该方法的线性范围、检出限(LOD)和定量限(LOQ)进行验证,结果见表3。参考限度范围要求,配制系列浓度标准溶液,得到目标化合物的线性范围、线性方程和相关系数,由于防腐剂测定浓度跨度较大,为了准确定量,采用分段回归的方法。采用样品空白基质溶液稀释标准溶液,以3倍信噪比和10倍信噪比确定方法的检出限和定量限。25种防腐剂在其各自的线性范围内线性关系良好,相关系数均大于0.995,方法的检出限为0.08～0.99 μg/kg,定量限为0.27～3.30 μg/kg。

表 3 25种防腐剂的线性范围、回归方程、相关系数(r)、检出限与定量限Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) of the 25 preservatives

表 3 (续)Table 3 (Continued)

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

2.3.2方法回收率和进样精密度

向水、乳液和膏霜3种性状的空白样品中添加4个不同水平的混合对照品溶液，进行方法回收率验证,采用内标法计算。苯甲醇、苯氧乙醇和苯氧异丙醇的添加浓度为0.040、0.16、1.0和4.0 mg/kg; MIT、MCIT和IPBC的添加浓度为0.010、0.040、0.25和1.0 mg/kg;其他对照品的添加浓度为0.020、0.080、0.50和2.0 mg/kg。结果表明,25种防腐剂的加标回收率为82.3%～119.4%, RSD≤14.3%(见表4)。

表 4 (续)Table 4 (Continued)

2.4 实际样品测定

对105批市售化妆品进行测定,包括20批婴幼儿护肤类、15批美白类、20批防晒类、20批沐浴类、20批面膜和10批其他非特殊类化妆品,其中典型色谱图见图2。对所测样品中防腐剂的使用种类、用量范围和使用频率(见表5)进行统计。结果表明,苯甲酸、氯苯甘醚、4-羟基苯甲酸异丁酯和MCIT存在超限添加的情况,约占总批数的6%;存在标签标识与检出结果不符的情况。防腐剂添加的种类、添加量与化妆品种类呈现一定的相关性:沐浴类化妆品主要使用苯甲酸类防腐剂;防晒类化妆品主要使用对羟基苯甲酸酯类防腐剂;婴儿护肤类主要使用苯氧乙醇;MCIT主要在沐浴类化妆品检出;面膜类化妆品中防腐剂含量较少。BHT在所有防晒类化妆品中均有检出,但标签标识的只有3批,该类抗氧剂容易光降解,存在安全风险[8], 《技术规范》并未指明其限度,后续应加强风险监测和监管。

图 2 实际化妆品样品中25种防腐剂的典型TIC图Fig. 2 Typical total ion chromatograms of the 25 preservatives in cosmetics samplesPeaks 3, 5, 6, 11, 13, 14, 17, 20, 21, 23 and 25 were the same as that in Table 1.

Compound Contents/(μg/kg)Baby skin care (n=20)Bathing (n=20)Sunscreen (n=20)Facial mask (n=20)Whitening (n=15)Others (n=10)Detection rate/%Benzoic acid15357-626627-718-3184227-4831.4Methyl benzoate------0Ethyl benzoate-5-16371)-1-531)-141)20.0Phenyl benzoate------0Benzyl benzoate-2-851)27-441)-461)-7.6Benzoates1531)13-79041)27-711)1-3711)42-461)27-621)38.1Methylparaben190-10641)1-4471)338-13431)31-36131)30-14111)110-6981)53.3Ethylparaben4461)951)21-3971)191)4221)4161)12.4Isopropyl paraben------0Propylparaben25-4081)28-541)153-7771)28-741)24-4031)1451)30.5Isobutylparaben-461)401)---1.9Butylparaben3651)731)621)---2.9Parabens111-18751)1-6681)360-21221)19-36131)55-22361)110-11141)58.1Benzyl alcohol-14-7803-1152-72-7615.2Phenoxyethanol1142-420564-563762-575956-2819130-5603380-526154.3Phenoxyisopropanol-19-17-19--2.9MIT7-807-9544-9410-8358-758-8434.3MCIT-6-22---7-181.9Benzyl salicylate31-381)8-4131)25-401)-411)109-1931)16.2Dehydroacetic acid1959-----1.0IPBC2-178-757-21-6-10615.2Chlorphenesin15904775145-340932-223231128.6DMDMH3312---1983-1.9BHA51-2-10-5-384-7.6BHT1-2491-8247-327-1-301746.7TBHQ------0BHQ------0

1): calculated on the basis of its acid; -: not detected.

3 结论

本研究建立了GC-MS/MS同时测定化妆品中25种防腐类化合物的检测方法,与《技术规范》收载方法相比,具有高专属性、高灵敏度和高通量性的特点,可以同时完成定性和定量,适用于多种基质、多种防腐剂同时使用的化妆品的测定,为化妆品中防腐剂的综合监控和管理提供了高效、可靠的技术支持。