基于香气成分气相色谱-质谱指纹图谱的判别分析和相似度评价用于绿茶等级差异研究

龙立梅, 宋沙沙, 曹学丽

(北京食品营养与人类健康高精尖创新中心, 北京工商大学食品学院,北京市食品风味化学重点实验室, 北京 100048)

我国是绿茶生产大国,在绿茶的流通和贸易领域,急需对其品质的科学评定方法。目前主要采用的是感官审评的方法,但该方法对品茶师的经验依赖性较强,容易出现主观偏差,执行中也存在不规范、不严格等问题。因而茶叶市场分级混乱,存在以次充好的情况。

在茶叶的感官评审中,香气对茶叶感官品质的贡献率达25%～35%[1],因此茶叶香气成分研究意义重大。指纹图谱技术主要应用于鉴别中药真伪和质量控制等,茶叶科研人员借鉴该方法,利用高相液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、红外及近红外光谱(IR-NIR)、核磁共振(NMR)等技术,得到能够标示茶叶品质特征成分的谱图;然后运用多种数据信息处理技术对指纹图谱进行分析,从而对茶叶品质做出客观量化的评价,有效弥补“感官审评”的缺陷[2]。目前茶叶指纹图谱技术已用于茶叶的品种鉴别,茶叶原料、半成品及成品茶的质量评价等[3-5],但是还没有在茶叶分等定级中应用的报道。

信阳毛尖茶是我国十大名茶之一,具有淡雅、清新的清香,并且香气持久,是河南省著名的地理标志产品之一[6]。本研究以信阳毛尖为研究对象,以茶汤香气成分为研究目标,采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术,通过建立绿茶香气成分GC-MS指纹图谱,将判别分析法与指纹图谱相似度法相结合,用以研究不同等级茶样之间的差异性,并用于茶样的等级判别,为绿茶品质评价和质量监控提供了一种科学量化的方法。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

供试茶样为当年4～5月的信阳毛尖茶,均来自信阳市文新茶叶有限责任公司,包括优质信阳毛尖茶“道”系列4个等级多个批次的22个茶样,按等级从高到低依次为观道(5个批次)、悟道(5个批次)、修道(6个批次)和品道(6个批次);普通信阳毛尖茶“300”系列3个等级多个批次的19个茶样,按等级从高到低依次为“330”(6个批次)、“320”(7个批次)和“310”(6个批次)。用复合铝箔袋密封样品,保存于4 ℃冰箱中,冷藏待用。正构烷烃标准样品(C7～C40),购至上海安谱科学仪器有限公司。

QP 2010 Plus气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司);手动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 57328-U萃取头(美国Supelco公司); HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1GC-MS指纹图谱建立方法

参照中国国家标准GB/T 23776-2009[1]冲泡绿茶的程序,准确称取茶叶样品3.0 g,放入200 mL的三角瓶内,倒入150 mL沸水,用锡箔纸封口,室温下静置5 min,待茶叶香气充分挥发和平衡。首先将其置于80 ℃恒温水浴锅中,同时将已经老化15 min的萃取头插入三角瓶内茶汤的上方,将固相微萃取(SPME)的手柄固定好,推出萃取头并开始计时,顶空吸附60 min后取出,立即插入气相色谱仪进样口,在250 ℃条件下热脱附5 min,进行GC-MS检测[7]。每份信阳毛尖茶样品均做5针平行实验。将所获得的同一等级的GC-MS总离子流图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(版本2012.130723),生成相应等级茶叶的GC-MS对应指纹图谱。

GC-MS分析条件如下。Rxi-5 MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升温程序:初始温度为40 ℃,保持3 min,以4 ℃/min速率升到80 ℃,保持2 min,再以2 ℃/min速率升到160 ℃,不保持,最后以12 ℃/min速率升到250 ℃,保持3 min,升温程序结束;进样口温度:250 ℃;载气:高纯He(纯度99.999%);柱流量:1.0 mL/min;采用不分流进样方式。EI电离源;离子源温度为200 ℃;离子化电压为70 eV;质谱扫描范围m/z35～450;检测器为1.00 kV。在同样的条件下,对正构烷烃混合物进行分析,获得各个正构烷烃成分的保留时间。

1.2.2香气成分的分析及特征成分的筛选

对总离子色谱图(total ion chromatogram, TIC)各峰积分,积分参数斜率为5 000/min,半峰宽为2 s,变参时间为1 000 min;得到的色谱质谱数据与NIST(US National Institute of Standards and Technology)质谱库匹配,挑选出与目标物质匹配度≥80的色谱峰,并将各峰测定的保留指数与NIST谱库提供的保留指数(RI)进行比较,个别与文献值比较,确定各个色谱峰对应物质的名称。用各色谱峰的峰面积与总峰面积之比计算出各香气组分的相对含量。

保留指数的计算采用以下公式:

(1)

式中,RI是待测组分的保留指数;RTunknown是待测组分的保留时间;RTn、RTn+1分别是待测组分前后正构烷烃的保留时间;n为正构烷烃的碳原子数。

绿茶的香气是其所含的不同芳香物质以不同浓度组合的综合表现;一般情况下,含量较多的成分对香气的贡献较大,而相对含量较少的物质未必对香气的贡献较少[8,9]。因此,分别对不同批次、不同等级信阳毛尖茶检出的所有香气成分进行汇总、分类和筛选,从而确定信阳毛尖茶的共有峰作为香气指纹图谱的特征峰,建立特征香气共有峰指纹图谱。所筛选出的香气特征成分总量在检出的香气物质总量中均达到70%以上,具有一定的代表性,可以反映指纹图谱的特征信息。

1.2.3不同等级信阳毛尖茶的判别分析

以信阳毛尖茶2个系列7个等级样品为研究对象,采用判别分析法对41个茶样进行等级判别。所得到的每个样品色谱图中,以最大主峰为参照,计算相对峰面积,以7个等级41个样本的23个共有峰的相对峰面积作为原始数据,采用SPSS 20.0软件,使用步进式方法中的Wilks λ法进行逐步判别分析,建立判别方程,并对所建立的判别方程进行交叉验证分析,验证判别方程对初识分组的分类结果[7,10-12]。

1.2.4相似度计算方法的选择

相比于绿茶在产地、种类上的差异,同种绿茶的不同等级之间的差异判别属于小类水平上的区别,其茶汤香气成分的物质种类大多数相同,差异主要体现在物质成分的含量上。所以选择适合同种绿茶不同等级的相似度计算方法是体现差异的关键。综合考虑现有多种相似度计算方法后,本文选择了夹角余弦法[13]、相关系数法[14]、新模型负指数法[15]、改进Nei系数法[16]、改良程度相似度[17]、新改良程度相似度[18]六种计算方法,进行同种绿茶不同等级之间相似度计算,这六种方法对应的计算公式如式(2)～(7)所示。

(2)

(3)

改进的Nei系数法[15]:

(4)

(5)

(6)

(7)

以优质信阳毛尖“道”系列和普通信阳毛尖“300”系列7个等级多个批次样品的23个特征滋味成分的GC-MS平均峰面积为计算参数,利用Excel软件的数据处理功能,以最高级别观道茶样指纹图谱为参比,将各级茶样的23个特征峰的平均峰面积分别代入6种相似度计算方法的公式中,得到各等级茶样与最高级别观道茶样的指纹图谱的相似度。

2 结果与讨论

2.1 方法重现性考察

方法的重现性是在相同测量条件下,对同一被测量样品进行连续多次测量后所得结果之间的一致性,是衡量实验方法可行性和适用性的重要指标。将同一茶样在相同实验条件下重复分析5次,测定结果显示,色谱峰保留时间的RSD均小于0.1%。相对峰面积的RSD,除个别含量较低的色谱峰为10.0%左右,绝大多数均小于10.0%。结果说明重现性好,符合指纹图谱建立的指标要求。

图 1 信阳毛尖茶“道”系列4个等级和“300”系列3个等级的GC-MS指纹图谱Fig. 1 GC-MS fingerprints of four grades of “Dao” series and three grades of “300” series of Xinyang Maojian tea

2.2 各等级信阳毛尖茶香气GC-MS指纹图谱的建立

分别建立了信阳毛尖茶“道”系列4个等级和“300”系列3个等级的香气成分GC-MS指纹图谱。图1中“道”系列4个等级指纹图谱对比图,自上而下依次为观道、悟道、修道和品道;300”系列3个等级指纹图谱对比图,自上而下依次为“330”“320”和“310”。

表 1 信阳毛尖茶23个特征香气成分Table 1 23 characteristic aroma components of Xinyang Maojian tea

2.3 信阳毛尖茶香气特征成分的确定

根据信阳毛尖多个批次、不同等级的41个样品的指纹图谱,筛选共有峰。41个茶样中均含有23个主要挥发性成分(见表1)。所筛选的23个挥发性成分总量占信阳毛尖茶总挥发性成分的70%以上,具有一定的代表性,可以反映指纹图谱的特征信息。

图 2 基于GC-MS指纹图谱的信阳毛尖茶“道”系列和“300”系列等级判别分析Fig. 2 Discriminant classification of Xinyang Maojian tea “Dao” series and “300” series based on GC-MS fingerprints

2.4 基于香气特征成分的信阳毛尖茶等级判别分析

以信阳毛尖茶“道”系列22个样本和“300”系列19个样品的23个共有峰的相对峰面积为原始数据,利用SPSS 20.0软件建立典型判别函数,对41个样本的等级区分正确率为98%。由如图2可知,两个系列之间及同一系列内不同等级茶样之间都能实现很好的判别区分。对“道”系列22个样品和“300”系列19个样品,分别按相同方法分别进行判别分析,对初始分组样品的等级区分判别正确率均为100%,如图3所示。分系列进行判别分析,等级之间的区分度更加显著。结果表明,采用香气特征成分可以对信阳毛尖茶样进行很好的等级判别。

表 2 信阳毛尖茶“道”和“300”系列GC-MS指纹图谱相似度计算Table 2 Similarity calculation of GC-MS fingerprints for “Dao” series and “300” series of Xinyang Maojian tea

图 3 分别基于GC-MS指纹图谱的信阳毛尖茶“道”系列和“300”系列等级判别分析Fig. 3 Discriminant classification of Xinyang Maojian tea “Dao” series and “300” series based on GC-MS fingerprints separately

2.5 不同等级信阳毛尖茶GC-MS指纹图谱相似度评价

指纹图谱的相似度评价不仅可以反映不同等级绿茶之间的差异,还可以体现出差异程度的大小,以量化形式表达等级之间的差异。以信仰毛尖茶最高级别观道茶样指纹图谱为参照,以6种相似度计算方法计算7个等级茶样的相似度,结果如表2所示。从中可以看出,不同的相似度计算方法均可以在不同程度上反映等级之间的差距,但是其中夹角余弦法、相关系数法、改进Nei系数法3种方法反映出的等级之间的差异区分度不显著。从多种相似度计算方法所得结果可知,整体上优质“道”系列茶样与普通“300”系列茶样之间有较大的区分。对于优质“道”系列4个等级的茶样,随着茶叶品质从观、悟、修、品逐级降低,其相似度也呈现下降的趋势,且以新改良的相似度法区分度最大。从相似度数据可以看出,与顶级的观道茶相比,悟、修、品级茶在香气成分上有显著的差异,三者之间的差异可以区分等级,但并不显著。对于普通的“300”系列3个等级茶样,其相似度值与优质“道”系列茶样,尤其是前3个等级的差异较显著。其3个等级之间存在一定的差异性,但差异程度较小,且出现等级交错现象。这可能是由于“300”系列茶样整体级别较低,等级区分度较小,感官审评不易区分或分级不严格。

指纹图谱相似度的大小可以反映该各等级茶样与最高的参比等级的相似程度。相似度数值越小,相似程度越低。从计算结果可以看出,不同等级茶样与参比等级茶样指纹图谱的相似度值与茶样所定的等级之间具有较好的相关性,相似度差异越大,茶样等级越低。

3 结论

以信阳毛尖茶“道”系列和“300”系列共7个不同等级41个样品为主要研究对象,分别建立了每个等级茶样的香气GC-MS指纹图谱,以筛选的23个香气特征成分的相对含量为原始数据进行判别分析。结果显示,该方法能够很好地体现出信阳毛尖茶两个系列不同等级之间的差异性,在各系列茶样内判别分析的区分度更高。说明采用基于香气成分GC-MS指纹图谱特征成分的判别分析,可以对同一品种不同等级茶样进行很好的等级区别。同时,以23个香气特征成分为目标,采用六种指纹图谱相似度计算方法,对不同等级茶样的相似度进行评价。结果显示,优质“道”系列茶样与普通“300”系列茶样的香气成分GC-MS指纹图谱相似度有较大的差异。“道”系列4个等级的茶样指纹图谱相似度与其等级之间有较好的相关性,随着茶叶品质从观、悟、修、品逐级降低,其相似度也呈现下降的趋势。普通信阳毛尖茶“300”系列3个等级茶样之间存在一定的差异性,但差异程度较小,且出现等级交错现象。总体而言,基于香气成分GC-MS指纹图谱的判别分析法与相似度计算法可以从不同角度、不同层面体现出同一种绿茶不同等级之间的差异性,可以为绿茶的品质区分和分等定级提供一种客观量化的方法选择。