香水莲花提取物对东莨菪碱诱导记忆障碍小鼠学习记忆能力的影响

王 微，叶虔臻，项 婷，吴晓琴，沈建福

浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州 310058

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease ,AD)是一种常见的神经退行性疾病，其临床主要表现为记忆力减退和认知功能障碍。研究表明，影响AD患者的认知障碍的发病机制十分复杂，存在多种假说，如胆碱能损伤假说、氧化应激假说、Aβ毒性假说、Tau 蛋白假说等[1]。另外，AD患者的短期和长期记忆还受到神经元分子水平上的调节。脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor,BDNF)影响神经元的存活、分化和生长，并且介导突触可塑性和认知过程，其水平的变化与认知障碍密切相关[2]，而ERK/CREB/BDNF信号通路的激活可能是开发具有记忆增强特性的新化合物有希望的靶点[3]。就目前而言，临床治疗AD的首选药物还主要是针对胆碱能损伤假说研发的乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)抑制剂，包括多奈哌齐、加兰他敏、卡拉巴汀和石杉碱甲(Huperzine A,Hup.A)等。但是，这些药物只能减轻症状，并不能延缓或阻止AD的病程，还具有一定的副作用。因此，研究者正积极寻找一种天然、安全、有效的预防和治疗手段。

香水莲花(Nymphaeahybrid)是睡莲科睡莲属热带大型睡莲，集观赏和食用价值于一身，其食用安全性已经得到证实[4]。研究证实，香水莲花富含多酚类化合物，具有较强的抗氧化能力，且整花优于花瓣，蓝色花和紫色花优于黄色花[5]。香水莲花中已鉴定出有柚皮素、柯里拉京、蜡菊素A等化合物[6,7]。其中，柚皮素和柯里拉京在神经保护方面具有一定的作用[8,9]。目前，国内外对香水莲花生物学活性的研究较少，而香水莲花对学习记忆能力的影响更是未见报道。基于此，本研究采用腹腔注射东莨菪碱(scopolamine,SCO)建立记忆障碍的AD小鼠模型，研究香水莲花提取物对小鼠学习记忆能力的影响，并对其作用机制进行探究，以期为进一步研究香水莲花的食用价值，开发功能性食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝色香水莲花(干花)由杭州芸麒龙祥生物技术有限公司提供；东莨菪碱(批号S107418)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石杉碱甲，上海复旦复华药业有限公司；总超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱、BCA蛋白浓度等测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；BDNF抗体(ab108319)、CREB抗体(ab32515)、p-CREB(ab32096)抗体均购自Abcam公司；p-ERK1/2(#9106)、ERK1/2(#4696)抗体购自Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗购自Thermo Pierce公司；其他试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 实验动物

清洁级健康ICR雄性小鼠40只(体重30～35 g)，由浙江中医药大学动物实验中心提供，合格证号IACUC-20180319-05。饲养条件：自由饮水、进食标准小鼠饲料；室内适度通风，光照12 h，室温25 ℃，湿度(60±10)%。

1.3 仪器与设备

酶标仪，美国BioTek公司；低温高速离心机，德国Eppendorf公司；Mini-PROTEAN电泳系统以及MiniTrans-Blot转印系统，美国Bio-Rad公司；水平脱色摇床，国产华利达；Morris水迷宫装置，北京硕林苑科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 香水莲花提取物制备

香水莲花提取物(Nymphaeahybridextract,NHE)制备参照董柳青的方法[7]：蓝色香水莲花干花粉碎，过60目筛，称取香水莲花粉末200 g，按1∶10料液比(W/V)加入60%乙醇，50 ℃超声浸提1 h后，离心分离，上清液减压浓缩除去有机溶剂，真空冷冻干燥后得到香水莲花提取物，得率为34.68%。NHE经Folin-Ciocalteu法测得总酚含量为309.73±4.42 mg GAE/g，酚类化合物含量较高。

1.4.2 动物分组、给药及造模

ICR小鼠适应性喂养一周后，随机分为5组，每组8只：正常组、模型组、NHE低剂量组、NHE高剂量组、阳性对照组。NHE的低、高剂量组和阳性对照组分别灌胃给药200 mg/kg、400 mg/kg的NHE和0.2 mg/kg的阳性对照药石杉碱甲，正常组和模型组则以等量蒸馏水灌胃。每天上午8点给药，连续给药22天，并且每天一次，灌胃体积为0.02 mL/g。

在第17～22天进行Morris水迷宫行为学实验，测试时间在每天上午10点至下午4点之间。测试前30 min，模型组、阳性对照组、NHE低、高剂量组均腹腔注射东莨菪碱(3 mg/kg)，建立小鼠学习记忆障碍模型。正常组则注射等量生理盐水。腹腔注射体积为0.01 mL/g。

1.4.3 Morris水迷宫实验

根据文献[10]，采用Morris水迷宫实验测定小鼠空间学习和记忆能力。实验在给药的第17天进行，历时6天，分为定位航行实验和空间搜索实验两部分。(1)定位航行实验：实验开始前，让小鼠自由游泳2 min以适应周围环境。正式实验时，每天训练4次，每次从不同的入水点将小鼠面向池壁放入水池，仪器自动记录从入水到找到水下隐蔽平台并立于其上所需时间即逃避潜伏期。如果小鼠在60 s内未找到平台，由实验者将其引至平台上停留10 s，逃避潜伏期记为60 s。记录每天各组4次寻找平台的潜伏期，以4次的平均值作为当天寻找平台的潜伏期，此项用于检测动物的学习能力。(2)空间搜索实验：第6天撤除平台进行空间搜索实验，用于测量记忆保持能力。任选一个入水点将小鼠放入水中，记录60 s内小鼠的游泳轨迹并进行分析。计算小鼠停留在目标象限停留时间的百分比及穿越原平台的次数。

1.4.4 生化指标测定

行为学实验结束后，每组取4只，断头处死小鼠，迅速取出脑组织(分离海马和皮质)，称重，用冰冷的生理盐水洗净，然后加入9倍体积的冰冷生理盐水制成10%的脑组织匀浆，用低温离心机3 500 rpm离心10 min，取上清液，按照试剂盒的方法测定其中的SOD、MDA、GSH-PX等氧化应激相关指标，测定AChE活性及ACh含量等胆碱能系统相关指标[11]。

1.4.5 Western blot检测海马和皮质ERK-CREB-BDNF信号通路相关蛋白的表达

行为学实验结束后，每组取4只，断头处死小鼠，迅速取出脑组织，冰上分离海马和皮质，液氮保存。海马和皮质加适量RIPA裂解液冰上裂解15 min，12 000 rpm离心15 min，取上清，利用BCA 法测定总蛋白浓度。用10% SDS-PAGE分离蛋白样品，并转移到PVDF 膜上。用含5%脱脂奶粉的TTBS封闭膜1 h，加入一抗(BDNF(稀释1∶1 500)，CREB(稀释1∶800)， p-CREB(稀释1∶5 000)，ERK(稀释1∶2 000)， p-ERK(稀释1∶2 000)，β-actin(稀释1∶1 500)，4 ℃，过夜。次日，以TTBS洗膜3次，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h后TTBS洗膜，化学发光法检测蛋白条带，用BandScan 5.0软件进行分析。

1.4.6 数据处理与统计

实验结果均采用SPSS 20.0软件进行分析，数据均以表示。采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Morris水迷宫实验结果

2.1.1 定位航行结果

各组小鼠找到平台的逃避潜伏期如图1 所示，随着训练天数的增加，各组小鼠的逃避潜伏期均呈减少的趋势。训练第1天，各组小鼠的逃避潜伏期无显著性差异。第2～5天，与正常组相比，模型组小鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.01)，这说明东莨菪碱致记忆障碍模型成功建立；与模型组相比，NHE低、高剂量组的小鼠逃避潜伏期极显著缩短(P<0.01)，尤其是高剂量组；同样地，阳性对照组小鼠的逃避潜伏期在第2天时显著小于模型组(P<0.05)，第3～5天的训练中极显著小于模型组(P<0.01)。

图1 定位航行实验中各组小鼠的逃避潜伏期(n=8)Fig.1 Escape latency of each group of mice in the navigational experiment (n=8)注：*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较。Note:compared with the normal group,*P<0.05,**P <0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

2.1.2 空间探索结果

第6天撤去平台，让小鼠进行60 s的空间探索。如图2A和2B所示，与正常组相比，模型组小鼠的穿越平台次数和在目标象限停留时间百分比明显减少(P<0.01)；与模型组相比，NHE低、高剂量组和阳性对照组穿越平台的次数和目标象限停留的时间百分比明显增多(P<0.05或P<0.01)。而Morris水迷宫实验轨迹类型主要分为4 种：趋向型、直线型、随机型、边缘型[12]。小鼠的游泳轨迹如图2C所示，正常组以趋向型和直线型为主，表现为有目的的搜索；模型组以边缘型为主，表现为无目的的搜索；NHE低、高剂量组和阳性对照组改善了小鼠的游泳模式，尤其是高剂量组，趋向型轨迹增多。

2.2 NHE对小鼠脑组织SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影响

由表1可知，与正常组相比，模型组小鼠海马和皮质的SOD、GSH-PX活力均极显著降低(P<0.01)，MDA含量极显著升高(P<0.01)；与模型组相比，NHE低剂量组小鼠的海马和皮质的MDA含量极显著(P<0.01)减少，而SOD和GSH-PX活力的影响则无显著性差异；与模型组相比，NHE高剂量组小鼠的海马和皮质中SOD和GSH-PX活力显著升高(P<0.01,P<0.05)，MDA含量极显著降低(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组的小鼠皮质中SOD活力显著升高(P<0.05)，GSH-PX活力极显著升高(P<0.01)，海马中SOD和GSH-PX的活力有所提高但无显著性差异(P>0.05)，而海马和皮质中的MDA含量均极显著减少(P<0.01)。

图2 空间探索实验中各组小鼠的记忆保持能力(n=8)Fig.2 Memory retention ability of each group of mice in the space exploration experiment (n=8)注：*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较。Note:compared with the normal group,*P<0.05,**P <0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

表1 NHE对小鼠脑组织SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影响(n=4)

注：*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较。

Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

2.3 NHE对小鼠脑组织ACh和AChE的影响

如图3A和3B所示，与正常组相比，模型组小鼠海马和皮质的ACh含量极显著减少(P<0.01)，AChE活性极显著增加(P<0.01)；与模型组相比，NHE低、高剂量组小鼠的海马和皮质ACh含量均极显著增加，AChE活性极显著降低(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组小鼠的海马和皮质的ACh含量明显增加(P<0.01,P<0.05)，AChE活性极显著降低(P<0.01)。

2.4 NHE对小鼠脑组织ERK-CREB-BDNF信号通路的影响

为了进一步阐明NHE保护东莨菪碱诱导的记忆障碍的作用机制，本研究探究了NHE对BDNF、p-ERK和p-CREB表达的影响(图4)。如图5C所示，东莨菪碱明显降低了大脑海马和皮层中的BNDF蛋白的表达水平(P<0.01)。同时，低剂量的NHE(200 mg/kg)和石杉碱甲(0.2 mg/kg)可以预防东莨菪碱诱导的BDNF蛋白表达水平的降低(P<0.01)。此外，如图5A和5B所示，对ERK和CREB的磷酸化水平进行测定发现，低剂量的NHE(200 mg/kg)和石杉碱甲恢复了大脑海马和皮层中东莨菪碱引起的ERK和CREB磷酸化减少。

图3 NHE对小鼠脑组织ACh和AChE的影响(n=4)Fig.3 Effect of NHE on ACh and AChE in mouse brain tissue (n=4)注：*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较。Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P <0.01;compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

图4 免疫印迹实验检测小鼠脑组织ERK-CREB-BDNF信号通路的蛋白表达Fig.4 The protein expression of ERK-CREB-BDNF signaling pathway in mouse brain tissue by Western blot

3 讨论

研究证实AD的病理学特征主要为：受影响的脑区产生广泛的氧化应激、胆碱功能障碍、淀粉样斑块、神经元纤维缠结以及神经元的丢失等，尤其是在与学习和记忆密切相关的海马和前额叶皮质[13]，但是具体发病机制至今尚未十分清楚。为了寻求有效的防治手段，研究者从影响AD认知缺陷的不同机制出发，开发了各种体内外实验模型。其中，东莨菪碱诱导的记忆障碍动物模型，因其简单、经济、方便等优点，常用于防治AD活性化合物的初步筛选[14]。东莨菪碱是一种毒蕈碱受体拮抗剂，可以透过血脑屏障阻断中枢乙酰胆碱与其受体的结合，造成胆碱能神经信号传递障碍，从而干扰动物和人类的记忆，特别是学习获得和短期记忆的过程。研究证实，东莨菪碱能够影响动物的行为学、大脑的氧化应激状态和神经化学变化等多方面[15]。本研究采用腹腔注射东莨菪碱造模，通过Morris水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力。结果显示，与正常组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数和目标象限停留时间百分比显著减少，游泳轨迹以边缘型为主，说明记忆力障碍模型造模成功；与模型组比较，低剂量(200 mg/kg)的NHE即可逆转东莨菪碱对小鼠造成的记忆缺陷，具体表现在逃避潜伏期显著缩短，穿越平台次数和目标象限停留时间百分比显著增加，改善了小鼠的游泳模式。

广泛的氧化应激是AD患者脑内的主要特征[16]。大脑主要由脂质组成，且具有较高的耗氧率，使得其容易受到活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的攻击[17]。MDA是机体内的一种重要的脂质过氧化物产物，其含量的高低反映机体的氧化应激水平。而SOD和GSH-Px等超氧化物酶能够有效清除体内的ROS，其活性的高低能反映机体清除自由基的能力。MDA水平和SOD、GSH-Px活性可以综合评价体内的氧化应激水平。本研究结果表明，与模型组比较，NHE的干预，提高了小鼠海马和皮质的SOD、GSH-PX活性，降低了MDA含量，这提示NHE可能通过缓解脑内的氧化应激来改善东莨菪碱引起的记忆力障碍。

图5 NHE对小鼠脑组织ERK-CREB-BDNF信号通路的影响(n=4)Fig.5 Effect of NHE on ERK-CREB-BDNF signaling pathway in mouse brain tissue (n=4)注：(A)p-ERK蛋白的相对表达量；(B)p-CREB蛋白的相对表达量；(C)BDNF蛋白相对表达量；*P<0.05，**P<0.01，与正常组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较。Note:(A) relative expression of p-ERK protein;(B) relative expression of p-CREB protein;(C) relative expression of BDNF protein;compared with the normal group,*P<0.05,**P <0.01;compared with the model group, #P<0.05,##P<0.01.

胆碱能系统的异常与记忆障碍有关。AD患者脑内乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)的减少被认为是认知和记忆功能损伤的直接原因。ACh是人脑内的一种重要的神经递质，能调节认知功能和学习记忆过程。ACh能被AChE迅速分解，通过抑制AChE可以增加突触间隙中的ACh，从而改善认知功能。乙酰胆碱酯酶抑制剂依然是现阶段最有效的治疗手段。本研究结果表明，与模型组比较，NHE可以使东莨菪碱诱导的记忆障碍模型小鼠海马和皮层中ACh 含量增多，AChE 活性降低。这提示，NHE可能通过抑制AChE 的活性，减少ACh水解，维持胆碱能系统的功能。

ERK-CREB-BDNF信号通路的激活与提高学习记忆能力有关[3]。AD患者脑内和血清中BDNF的含量减少，并且不同病程阶段有所差别，与痴呆的严重程度相关[18]，可以作为AD的诊断指标之一。研究表明，天然产物则可以通过间接调节BDNF水平起到改善认知的作用，如蓝莓提取物[19]，文冠果提取物[20]等。环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)是一种转录因子，在BDNF转录调节中发挥重要作用，但是磷酸化的CREB 才能激活下游基因的表达，而CREB的激活依赖于细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路[21]。因此，ERK-CREB-BDNF信号通路的激活可以改善认知障碍。本研究结果显示，东莨菪碱造成小鼠海马和皮质中BDNF含量减少，ERK和CREB的磷酸化减少。而NHE(200 mg/kg)的干预减轻了东莨菪碱的损伤，使得ERK和CREB的磷酸化增加，BDNF的表达增多。这些结果表明，NHE的记忆增强作用可能是由大脑海马和皮质中ERK-CREB-BDNF信号通路的激活所介导的。

综上所述，NHE可以提高东莨菪碱诱导的记忆障碍小鼠的学习记忆能力，且200 mg/kg的剂量就能起相应的作用，具体机制可能涉及缓解大脑的氧化应激损伤，平衡胆碱能系统，激活ERK-CREB-BDNF信号通路。但是，NHE只是一个粗提物组分，含有309.73±4.42 mg GAE/g的酚类化合物，其他的成分可能是多糖、生物碱、皂苷[7]等，而发挥关键作用的化合物还需进一步研究。