大叶土蜜树化学成分及抗神经炎活性研究

冯 凯，华 沛，顾 琼，何 琳，滕希峰*，曾令杰*

1广东药科大学中药学院 国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室；2中山大学药学院，广州 510006；3广东药科大学医药化工学院 广东省化妆品技术研究中心，中山 528458

大叶土蜜树(Brideliaretusa)属于大戟科(Euphorbiaceae)土蜜树属(Bridelia)植物，别名虾公木、华南逼迫子，广泛分布于湖南、广东、海南、贵州和云南等省区[1]。大叶土蜜树作为药用植物在印度民间广泛用于治疗风湿、痢疾、腹泻等其他疾病[2,3]。据报道，其茎粗提物具有止痛、抗炎和抗菌等活性[4,5]。前期对于大叶土蜜树茎部分的化学成分研究报道较少，主要成分为三萜、倍半萜、黄酮以及酚类成分[2,5,6]。为了更加深入研究其物质基础并找到可能的抗炎活性成分，我们对产于云南的大叶土蜜树的茎部分进行了系统化学成分研究，从中提取分离到了11个化合物，分别鉴定为没食子酸(1)，木栓酮(2)，阿魏酸二十七烷脂(3)，芥子醛(4)，丁香醛(5)，丁香脂素(6)，补骨脂内脂(7)，补骨脂酚(8)，二十五烷酸(9)，亚油酸(10)，1-Linoleoylglycerol(11)。化合物3～11为首次从土蜜树属中分离得到。同时测定化合物1～11对LPS诱导BV-2细胞NO生成抑制活性。其中化合物4、5、10和11显示出较强的抗神经炎作用，其IC50分别为12.57、8.41、5.86、5.86 μM。

1 材料与仪器

LC-MS液质联用仪(美国Agilent公司)；1H NMR,13C NMR用Bruker Advance 500型或400型超导核磁共振仪(德国Bruker公司)测定，溶剂为CDCl3、CD3OD；柱层析填料：正相硅胶(200～300目，青岛海洋化工有限公司)，反相填充材料RP-18(40～75μm，Biotage公司)，Sephadex LH-20(瑞典GE healthcare)；GF254薄层层析正相硅胶板(青岛海洋化工有限公司)；显色剂为10%的硫酸乙醇溶液。

大叶土蜜树(B.retusa)茎部分于2015年9月采集于云南临沧，由中国科学院昆明植物研究所韩春艳博士鉴定，标本存放于中山大学药学院药物设计中心。

2 提取和分离

将大叶土蜜树(B.retusa)茎部分，8.4 kg，粉碎后称重，用95%乙醇在室温下浸泡提取4次，每次三天。过滤回收提取液并减压浓缩得粗提物400 g。粗提物用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液减压浓缩得到乙酸乙酯部分浸膏168 g。

将乙酸乙酯层浸膏用等量正相硅胶(200～300目，青岛海洋化工)拌样，经硅胶柱色谱，用三氯甲烷/甲醇进行梯度系统(v/v，1∶0→0∶1)得到6个组分Fr.A-F。Fr.B(1.6 g)经硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(v/v， 99∶1→80∶20)梯度洗脱得到亚组份Fr.B1-B7。Fr.B6(235 mg)经制备薄层得到化合物3(107 mg)，Fr.B5(58 mg)经薄层制备得到化合物6(22 mg)。Fr.C(34 g)经反相色谱柱(RP-C18)，用甲醇/水(v/v，30%→100%)梯度洗脱得到亚组分Fr.C1-C4。流分Fr.C1(10 g)经硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(v/v，7∶3→1∶1)梯度洗脱得到亚组分Fr.C1.1-Fr.C1.5。Fr.C1.3(864 mg)经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脱，得到Fr.C1.3.1-Fr.C1.3.3。Fr.C1.3.2(643 mg)经硅胶柱色谱，二氯甲烷/乙酸乙酯(v/v，95∶5→80∶20)梯度洗脱得到化合物4(4.7 mg)和5(3.9 mg)。Fr.C1.5(4.5 g)经凝胶Sephadex LH-20柱色谱，二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脱，得到Fr.C1.5.1-Fr.C1.5.5和化合物1(1.42 g)。Fr.C2(7 g)经硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(v/v，9∶1→1∶1)梯度洗脱得到化合物7(4 mg)。Fr.C3(4.4 g)经硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(v/v， 95∶5→1∶1)梯度洗脱和制备型HPLC得到化合物8(25 mg)、10(10 mg)和11(9 mg)。Fr.C4(3 g)经硅胶柱色谱，石油醚/乙酸乙酯(v/v，95∶5→6∶4)梯度洗脱和重结晶得到化合物2(12 mg)和9(18 mg)。

图1 化合物1～11的化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1-11

3 波谱数据和结构鉴定

化合物1淡黄色固体(MeOH);分子式为C7H6O5，ESI-MS:m/z169.1 [M-H]-;1H NMR (400 Hz,CD3OD)δ:7.01 (2H,s,H-2,H-6);13C NMR (100 Hz,CD3OD)δ:169.7 (C-7),145.7 (C-3,C-5),138.9 (C-4),121.3 (C-1),109.7 (C-2,C-6)。以上数据和文献[7]对照基本一致，故确定化合物为没食子酸。

化合物2无色针状结晶;分子式为C30H50O，EI-MS:m/z426 [M]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:1.18 (3H,s,H-28),1.05 (3H,s,H-27),1.00 (6H,s,H-26,H-30),0.95 (3H,s,H-29),0.88 (3H,d,J=7.0 Hz,H-23),0.87 (3H,s,H-25),0.72 (3H,s,H-24);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:213.5 (C-3),59.7 (C-10),58.5 (C-4),53.3 (C-8),43.0 (C-18),42.4 (C-5),41.8 (C-2),41.5 (C-6),39.9 (C-13),39.5 (C-22),38.5 (C-14),37.7 (C-9),36.2 (C-16),35.9 (C-11),35.6 (C-19),35.3 (C-29),33.0 (C-21),32.6 (C-15),32.3 (C-28),32.0 (C-30),30.7 (C-12),30.2 (C-17),28.4 (C-20),22.5 (C-1),20.5 (C-26),18.9 (C-27),18.5 (C-7),18.2 (C-25),14.9 (C-24),7.1 (C-23)。以上数据和文献[8]对照基本一致，故确定化合物为木栓酮。

化合物3白色粉末;分子式为C37H64O4，EI-MS:m/z572 [M]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:7.61 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7),7.06 (1H,d,J=8.1 Hz,H-6),7.02 (1H,brs,H-2),6.91 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.29 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8),6.01 (1H,s,OH),4.19 (2H,t,J=6.7 Hz,H-1′),3.91 (3H,s,OCH3),1.69 (2H,m,H-2′),1.38 (48H,m,H-3′～26′),0.86 (3H,t,J=6.7 Hz,H-27′);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:167.6 (C-9),148.2(C-4),147.0(C-3),144.8(C-7),127.2(C-1),123.2(C-6),115.8(C-5),114.9(C-8),109.6(C-2),64.8(C-1′),56.1(3-OCH3),26.2～32.1(C-3′～C-26′),22.9(C-2′),14.3(C-27′)。以上数据和文献[9]对照基本一致，故确定化合物为阿魏酸二十七烷脂。

化合物4黄色粉末;分子式为C11H12O4，ESI-MS:m/z209.1 [M+H]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:9.66 (1H,d,J=7.7 Hz,d,H-9),7.37 (1H,d,J=15.8 Hz,H-7),6.82 (1H,s,H-2,H-6),6.61 (1H,dd,J=15.8,7.7 Hz,H-8),3.94 (6H,s,2×OCH3);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:193.7(C-9),153.4(C-7),147.5(C-3,C-5),138.2(C-4),127.0(C-8),125.8(C-1),105.7(C-2,C-6),56.6(OCH3)。以上数据和文献[10]对照基本一致，故确定化合物为芥子醛。

化合物5淡黄色粉末;分子式为C9H10O4，ESI-MS:m/z183.1 [M+H]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:9.82 (1H,s,H-7),7.15 (2H,s,H-3,H-6),3.95 (6H,s,2×OCH3);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:190.9(C-7),147.5(C-3,C-5),141.0(C-4),128.6(C-1),106.9(C-2,C-6),56.6(2×OCH3)。以上数据和文献[11]对照基本一致，故确定化合物为丁香醛。

化合物7白色针状结晶;分子式为C11H6O3，ESI-MS:m/z187.1 [M+H]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:7.80 (1H,d,J=9.6 Hz,H-4),7.70 (1H,d,J=2.3 Hz,H-2′),7.69 (1H,s,H-5),7.48 (1H,s,H-8),6.83 (1H,dd,J=2.3,1.0 Hz,H-3′),6.38 (1H,d,J=9.6 Hz,H-3);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:161.3(C-2),156.6(C-7),152.3(C-9),147.1(C-2′),144.3(C-4),125.1(C-6),120.0(C-5),115.6(C-10),114.9(C-3),106.6(C-3′),100.1(C-8)。以上数据和文献[13]对照基本一致，故确定化合物为补骨脂素。

化合物8浅黄色油状;分子式为C18H24O，ESI-MS:m/z271.2 [M+H]+;1H NMR (400 Hz,CDCl3)δ:7.25 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2,H-6),6.77 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,H-5),6.25 (1H,d,J=16.0 Hz,H-7),6.05 (1H,d,J=16.0 Hz,H-8),5.88 (1H,dd,J=17.4,10.7 Hz,H-17),5.11 (1H,t,J=7.3 Hz,H-12),5.02 (2H,m,H-18),1.95 (2H,m,H-10),1.67 (3H,s,H-14),1.58 (3H,s,H-15),1.45 (2H,m,H-11),1.19 (3H,s,H-16);13C NMR (100 Hz,CDCl3)δ:154.9 (C-4),146.2 (C-17),136.0 (C-7),131.5 (C-1),131.0 (C-13),127.6 (C-2,C-6),126.7 (C-8),125.0 (C-12),115.6 (C-3,C-5),112.1 (C-18),42.7 (C-9),41.5 (C-10),25.9 (C-15),23.6 (C-16),23.4 (C-11),17.9 (C-14)。以上数据和文献[14]对照基本一致，故确定化合物为补骨脂酚。

化合物9白色粉末;分子式为C25H50O2，EI-MS :m/z382 [M]+;1H NMR (400 Hz,CDCl3)δ:2.28 (2H,t,J=7.5 Hz,H-2),1.56 (2H,m,H-3),1.20～1.30 (42H,m,21×CH2),0.88 (3H,t,J=6.6 Hz,H-25);13C NMR (100 Hz,CDCl3)δ:178.8 (-COOH),14.1(-CH3)。以上数据和文献[15]对照基本一致，故确定化合物为二十五烷酸。

化合物10无色油状;分子式为C18H32O2，EI-MS:m/z280 [M]+;1H NMR (500 Hz,CDCl3)δ:5.35 (4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13),2.77 (2H,t,J=6.7 Hz,H-11),2.34 (2H,t,J=7.5 Hz,H-2),2.05 (4H,q,J=7.0 Hz,H-8,H-14),1.63 (2H,m,H-3),1.25 (14H,m,H-4～7,H-15～17),0.82 (3H,t,J=6.7 Hz,H-18);13C NMR (125 Hz,CDCl3)δ:180.3(C-1),130.4(C-13),130.2(C-9),128.2(C-12),128.0(C-10),34.3(C-2),31.7(C-16),29.7(C-7),29.5(C-15),29.3(C-6),29.2(C-5),29.2(C-4),27.4(C-8),27.3(C-14),25.8(C-11),24.8(C-3),22.7(C-17),14.2(C-18)。以上数据和文献[16]对照基本一致，故确定化合物为亚油酸。

化合物11无色油状;分子式为C21H38O4，EI-MS:m/z354 [M]+;1H NMR (400 Hz,CDCl3)δ:5.35 (4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13),4.20 (1H,dd,J=11.7,4.7 Hz,Ha-19),4.14 (1H,dd,J=11.7,6.1 Hz,Hb-19),3.92 (1H,m,H-20),3.69 (1H,dd,J=11.5,3.9 Hz,Ha-21),3.59 (1H,dd,J=11.5,5.8 Hz,Hb-21),2.76 (2H,t,J=6.4 Hz,H-11),2.35 (2H,t,J=7.6 Hz,H-2),2.04 (4H,q,J=6.8 Hz,H-8,H-14),1.62 (2H,m,H-3),1.31 (14H,m,H-4～7,H-15～17),0.88 (3H,t,J=6.7 Hz,H-18);13C NMR (100 Hz,CDCl3)δ:174.6(C-1),130.4(C-9),130.2(C-13),128.3(C-10),128.1(C-12),70.5(C-20),65.4(C-19),63.5(C-21),34.3(C-2),31.3(C-16),29.8(C-7),29.6(C-6),29.4(C-15),29.3 (C-5),29.3(C-4),27.4(C-8),27.4(C-14),25.8(C-11),25.1(C-3),22.8(C-17),14.3(C-18)。以上数据和文献[17]对照基本一致，故确定化合物为1-Linoleoylglycerol。

4 化合物的抗神经炎症活性筛选

采用LPS诱导的小鼠小胶质细胞BV-2细胞，评价11个化合物的抗神经炎症活性。

用Griess试剂检测LPS刺激的BV-2小鼠小胶质细胞上清液中的NO水平。将处于对数生长期的BV-2细胞按4×105个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，细胞培养48 h之后，吸除旧培养基，加入80 μL DMEM。30 min后，加入10 μL待测化合物预处理30 min，最后加入10 μL LPS ( 1 μg/mL ) 诱导细胞产生炎症。化合物作用24 h，吸取50 μL细胞上清液于新的96孔板中，依次加入50 μL Griess试剂Ⅰ、试剂Ⅱ。用多功能酶标仪工作站检测其在540 nm处的吸收强度。

活性测试结果发现化合物4、5、10和11具有较强的抑制NO生成活性，其IC50值分别为12.57、8.41、5.86、5.86 μM。

5 结论

本研究从大叶土蜜树(B.retusa)茎部分的醇提物中分离鉴定了11个化合物，其中，化合物3～11为首次从土蜜树属中分离得到。对分离到的11个化合物进行抗神经炎活性研究，其中酚酸类化合物4、5、10和11有较强的抗神经炎活性。据文献[18]报道，化合物5对脑缺血损伤的大鼠具有一定的神经保护作用。化合物4、10、11为首次报道具有抗神经炎活性，这为酚酸类化合物的药物开发利用提供一定的依据。