南亚热带海岸沙地不同林分土壤微生物功能多样性及影响因素

岳新建 ，叶功富 ，陈梦瑶 ，高 伟 ，4，李 蝶 ，邹燕惠

土壤微生物是重要的分解者，在土壤肥力形成和营养物质循环中起着重要作用，且对土地利用方式和经营管理措施变化敏感，监测土壤微生物多样性有助于及时了解土壤质量的变化[1]。微生物多样性包括群落多样性、遗传多样性和功能多样性3个层次，其中，功能多样性是反映微生物生态功能的重要指标，是当前森林土壤研究的热点之一[2]。Biolog-eco微平板法是微生物功能多样性研究的常规方法，可以直观反映出土壤微生物利用碳源的差异[3]，间接的反映出微生物组成的多样性。与PLFA法、高通量测序等分子生物学方法以及传统的稀释平板法等相比，具有操作简便、不需分离培养、最大限度保存微生物代谢特征等优点[4]，已被广泛应用于评价不同土壤类型、不同土地利用类型[5]、不同植被类型及植被恢复方式[6-12]、不同海拔高度[13]等土壤微生物功能多样性。已有研究表明，土壤微生物多样性与植被类型及土壤经营管理方式等有关，不同植被类型及同类植被的不同发育阶段土壤微生物多样性差异显著。

风沙土是福建东南沿海地区主要的非地带性土壤类型之一，由海沙风积而成，土（沙）层深厚但发育较弱。由于地处南亚热带，雨热同期，淋溶现象严重，不利于养分、有机碳等的固持。以木麻黄纯林为主的沿海防护林体系是滨海风沙地的主要乔木植被，在减轻风沙危害、改善区域小气候等方面发挥了不可估量的作用。但20世纪50年代起营造的木麻黄林分生理成熟期、防护成熟期已过，亟需要更新以确保其防护功能不下降。叶功富等对不同林龄、不同树种、不同混交模式及更新方式对土壤养分循环、能量循环进行了较系统的研究[14-19]，认为在滨海沙地上营造混交林对提高沙土肥力、促进形成稳定高效的乔木生态系统具有积极意义。当前福建滨海沙地常见的森林植被有木麻黄Casuarina equisetifolia、尾巨桉Eucalyptus grandis×E.urophylla、湿地松Pinus elliottii、卷荚卷荚相思Acacia crassicarpa等为优势树种的人工林分，以及少量以乡土阔叶树种如潺槁木姜子Litsea glutinosa、朴树Celtis sinensis等为建群种的天然次生林（Secondary forest）。目前较少见有关不同树种对滨海风沙土微生物功能多样性影响的研究。

研究从滨海沙地典型林分土壤微生物碳源代谢特征及影响因素入手，探讨不同树种对沙土质量改良作用的差异，可为实现沿海防护林体系的可持续发展提供理论指导。

1 材料及方法

1.1 研究区概况

研究区位于福建省东南沿海的东山县赤山国有防护林场（117°24′22.17″E，23°38′21.22″N），属南亚热带海洋性季风气候，1月份平均气温13.1 ℃，7月份平均气温27.3 ℃，多年平均气温为20.8 ℃，年积温7 400～7 700 ℃，终年无霜冻；雨热同期，年平均降水量1 104 mm，年均蒸发量2 028 mm；干湿季明显，雨季集中在5—9月，约占全年降水量的61%，年相对湿度80%，11月至翌年2月为旱季。研究期内降水量及土壤温度情况，详见图1。土壤主要为非地带性的风积沙土，厚度在1.0 m 以上，以细砂（0.05～0.25 mm）为主（质量占90%以上），保水保肥能力差。现状植被为以木麻黄纯林为主的沿海防护林体系，其中海岸前沿以木麻黄纯林为主，后沿有部分桉树类、松类、相思类、竹类等纯林或混交林分以及少量以潺槁木姜子、朴树等乡土阔叶树种为建群种组成的天然次生林分。

图1 研究期内月均降水量及土壤温度Fig.1 Monthly cumulative precipitation and monthly mean air temperature during the experimental period

1.2 样地设置

首先根据最新森林资源建档资料筛选出木麻黄、尾巨桉、湿地松、卷荚相思4种人工林分以及天然次生林分小班，然后根据林龄、林分健康状况、与海岸线距离等因素确定监测样地位置。所选小班均位于林带后沿，距离海岸线3.0～5.0 km，湿地松、卷荚相思、木麻黄均为1993年春季造林，天然次生林林龄超过50年（询问当地群众获得）。采用相邻格子法，每种林分设置4个20 m×20 m样地，样地之间设置3～5 m隔离带。对样地内胸径≥5 cm的乔木进行每木检尺，在4个角点外分别设置1个2.0 m×2.0 m样方，记录灌木草本种类、盖度等因子，详见表1。经调查，4种人工林分林下植被稀疏，灌草盖度均在5%以下；次生林植被相对丰富，乔木优势树种为潺槁木姜子和朴树，灌木有毛果算盘子Glochidion eriocarpum、豺皮樟Litsea rotundifolia等，草本有沿阶草Ophiopogon bodinieri和荩草Arthraxon hispidus等，灌草盖度在20%左右[20]。除木麻黄凋落物被人为耙除外，其他4种林分凋落物层保存较好，厚度10～15 cm。5种林分现状调查情况，见表1。

表1 五种林分现状调查Table 1 Investigation on status quo of five forest stands

1.3 样品采集及处理

2015年9月下旬在样地内沿对角线“S”形取表层（0～10 cm）土壤，每个样地取10个点，混合均匀后过2 mm筛，取300 g左右装入保温箱内带回实验室。一部分在4 ℃冰箱内保存，24 h以内进行土壤微生物功能多样性实验；另一部分风干后测定全碳、全氮、有效磷、交换性钾、阳离子交换量等指标。

1.4 土壤理化性质测定

土壤全碳（TC）和全氮（TN）采用元素分析仪（德国Elementar公司，VARIOMAX CN）测定；其他土壤理化性质采用鲍士旦所著《土壤农化分析》中的方法。土壤容重（ρ）采用环刀法测定；土壤速效磷（Available phosphorus，AP）用碳酸氢钠法测定；土壤交换性钾（Exchangeable potassium）用乙酸铵交换-火焰光度法测定。有效磷（Available phosphorus，AP）采用盐酸－硫酸溶液浸提法；土壤pH值采用土水比为1∶2.5测定；土壤阳离子交换量（CEC）采用乙酸钠-火焰光度法测定。

1.5 土壤微生物功能多样性测定

土壤微生物功能多样性采用Biolog-eco微平板法测定，所需ECO板采购自美国BIOLOG公司，方法参考Classen AT等（2003）[21]。

Biolog-eco板中共含有31 种碳源，按照化学基团性质，可细分为碳水化合物类（Carbohydrate）、氨基酸类（Amino acids）、羧酸类（Carboxylic acids）、多聚物（Polymer）、酚酸类（Phenolic acids）、胺类（Amine）6 类，详见表2。

表2 31种碳源分类Table 2 Classification of 31 kinds of carbon sources

操作流程：准确称取10 g 烘干（105 ℃）的新鲜土样，加入到盛有90 mL 0.85%（w/v）灭菌NaCl溶液的三角瓶中，用封口膜封好；200 r/min振荡30 min，10倍稀释法用0.85%（w/v）NaCl无菌溶液将其稀释至10-4。静置10 min，取上清液150 μL接种至Biolog-eco微孔板上，置于暗箱内28 ℃恒温培养，每隔12 h用多功能酶标仪（Synergy H4，美国）测得590 nm（颜色+浊度）波长和750 nm（浊度）波长下的吸光度值（Optical density，OD值），并计算平均颜色变化率（Average well color development，AWCD），共培养 240 h（10 d）。用培养144 h的单孔光密度，计算其微生物功能多样性指数，并进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

式中：Ci为第i个碳源孔OD值；R为对照孔OD值，若Ci-R≤0，计为0；ni是第i孔的相对吸光度值；Pi为ni与整个平板相对吸光值总和的比率。

1.6 数据处理与分析

应用SPSS 18.0进行单因素方差分析（Oneway ANOVA）、主成分分析和相关性分析；应用Origin 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同林分类型土壤理化性质的差异

由表3可知，5种林分类型表层土壤理化性质存在较明显差异。其中，土壤容重在1.16～1.44 g·cm-3，天然次生林最低（P＜0.05），木麻黄最高，其它3种林分相差不大。从土壤pH值来看，天然次生林土壤趋于中性，其它4种林分趋于酸性。土壤碳、氮含量方面，次生林含量均最高，其它4种林分差异不显著。次生林还有较高的有效磷、交换性钾及阳离子交换量。

表3 五种林分表层土壤（0～10cm）理化性质（平均值±标准偏差）†Table 3 Physicochemical properties of five kinds of stand topsoil (0-10 cm)(mean value + standard deviation)

2.2 不同林分类型土壤微生物利用碳源的动力学特征

AWCD值是反应土壤微生物利用碳源能力的重要指标，可反映出土壤微生物活性以及微生物利用单一碳源的速率。利用不同林分4个重复每隔24 h测得AWCD值的平均值绘制动态变化曲线（图2）。可以看出，不同林分的AWCD值均随培养时间呈增大的趋势，表明土壤微生物活性均随着培养时间的延长而增强。从接种开始至24 h，AWCD值变化不明显，说明该阶段土壤微生物几乎未开始代谢碳源或代谢非常微弱；24 h后快速上升，表明该阶段碳源开始被大量利用，其中天然次生林增长最为显著，4种人工林分则速率、趋势相似，144 h至培养结束（240 h）增速趋缓，最高至0.5左右，其中，次生林值最大，其次为尾巨桉，湿地松最小。整个培养过程中，次生林AWCD值始终最大，其他4个树种差异不明显。

图2 不同类型林分土壤微生物AWCD随培养时间的变化Fig.2 AWCD variation trends of five forest types during incubation time

2.3 不同林分土壤微生物对6种碳源利用情况分析

分析各类碳源的AWCD值可判断不同林分土壤微生物对特定碳源的利用能力。由图3可以看出，5种林分对6种碳源的利用有一定差异。从对羧酸类碳源（Carboxylic acids）的利用情况上看，桉树利用最强，其次为木麻黄，湿地松利用最弱；对多聚物类碳源（Polymer）利用上看，桉树最强，其次为卷荚相思，木麻黄最弱；从对碳水化合类碳源（Carbohydrate）利用上看，次生林最强，其次为尾巨桉，卷荚相思最弱；对酚酸类碳源（Phenolic acids）利用上看，尾巨桉最强，其次为湿地松，卷荚相思最弱；从对胺类碳源（Amine）利用上看，次生林最强，其次为尾巨桉，湿地松最弱；从对氨基酸类碳源（Amino acids）利用上看，次生林最强，其次为尾巨桉，湿地松最弱。

对培养至144 h时6种碳源的AWCD值进行方差分析（表4）。5种林分对羧酸类、多聚物类、酚酸类碳源利用差异不显著（P＞0.05）；次生林利用碳水化合物类碳源与尾巨桉、湿地松、卷荚相思差异显著（P＜0.05），与木麻黄差异不显著，4种林分之间差异不显著；次生林与湿地松利用氨基酸类差异显著，其他不显著；胺类利用方面，次生林与木麻黄差异显著，与卷荚相思差异不显著，4种人工林分之间差异不显著。

图3 不同林分类型土壤微生物利用6种碳源的变化趋势Fig.3 AWCD variation trends of six carbon sources utilized by soil microorganism in different forest types

表4 培养144h后不同林分对6种碳源的情况（平均值±标准偏差，n=3）†Table 4 Utilization ratio to six kinds of carbon sources of five forest types after cultivated 144 hours(mean value + standard deviation, n=3)

2.4 不同林分类型微生物利用碳源的主成分分析

AWCD值可以反映土壤微生物利用碳源（含碳源类型）的总活性，但难以反映单一碳源的利用情况。Biolog-ECO板有31种碳源，其AWCD可构成多元向量。利用主成分分析（PCA）进行降维，提取出相关性较强的几种碳源，有助于更全面地分析微生物群落代谢功能的特性。以培养144 h不同林分31种碳源的AWCD均值做主成分分析（PCA）。由表5可知，前3个主成分累积方差贡献率达92.61%，前2个主成分的方差累积贡献率为78.87%，PC1与PC2解释方差分别为45.14 %、33.73%，说明前2个主成分可解释微生物碳源利用的主要贡献者。以 PC1为X轴，PC2为Y轴，以5种林分31种碳源在2个主成分上的得分值作图，得到土壤微生物碳源利用主成分分析图。由图4可以看出次生林与其他4种林分相比具有独特的碳源利用方式，且活性较强；4种人工林分具有类似的碳源利用特征。

表5 主成分分析计算结果Table 5 Results of principal component analysis (PCA)

初始载荷因子为各碳源与各主成分的相关系数，载荷因子值越高，表示该碳源对主成分的影响越大[22]。由表6可以看出，对PC1影响较大（相关系数r＞ 0.7，下同）的碳源有15种，其中碳水化合物类6种，氨基酸类3种，羧酸类2种，酚酸类1种，胺类2种，多聚物类碳源1种；对PC2影响较大的碳源主要有9种，其中碳水化合物类4种，羧酸类2种，氨基酸类2种，多聚物1种，影响第3主成分的碳源有3种，碳水化合物、酚酸、羧酸各1种。

图4 不同林分表层（0～10 cm）土壤微生物对碳源利用的主成分分析Fig.4 PCA analysis on carbon source utilization by soil microbial communities of top layer (0-10 cm) in five forests

2.5 不同林分土壤微生物对碳源利用的多样性指数分析

根据培养144 h的AWCD 值计算土壤微生物多样性指数，包括Shannon-Wiener物种丰富度指数（H）、Simpson优势度指数（D）和McIntosh均匀度指数（U）（表7）。Shannon-Wiener 指数（H′）对物种丰富度敏感，主要用来评价土壤微生物群落物种丰富度，从结果看，5种林分丰富度差异不显著，但次生林H′值最高，说明次生林微生物多样性最为丰富。McIntosh 指数（U）可度量微生物落的均一度。次生林与4种人工林分差异显著（P＜0.05），木麻黄与湿地松差异显著（P＜0.05），尾巨桉与卷荚相思差异不显著。Simpson指数差异分析表明次生林与尾巨桉差异显著（P＜0.05），与木麻黄、湿地松、卷荚相思差异不显著。

表7 不同林分表层土壤微生物多样性指数†Table 7 Functional diversity indices for soil microbial communities on the surface soil in different forest stands

2.6 土壤微生物多样性指数与土壤理化性质的关系

对五种林分表层土壤主要理化性质与微生物功能多样性指数进行相关分析，以探讨各因子之间的相关性。由表8可以看出，Simpson优势度指数与土壤pH值、有效磷极显著正相关（P＜0.01），与土壤全碳、交换性K显著正相关（P＜0.05）；Shannon多样性指数（H′）与pH值、有效磷显著正相关（P＜0.05）；McIntosh 指数与pH、有效磷、全碳、交换性钾等呈正相关，与全氮（TN）负相关。土壤微生物指数与阳离子交换量均呈正相关。

表8 滨海沙地土壤微生物功能性多样指数与理化性质相关分析†Table 8 Correlation analysis between soil microbial functional diversity and soil physical-chemical properties on costal sandy land

3 讨 论

3.1 不同林分类型土壤微生物功能多样性的差异

滨海沙地人工造林在改善区域生态环境、促进沙土发育上发挥了重要作用[14]，尤其是近年来沿海防护林保护力度加大，形成了较为稳定的人工森林群落。不同树种生物学特性不同，对土壤的改良效果也有一定差异。已有研究表明，不同树种森林土壤往往具有各异的微生物群落结构[23-24]。通过10 d的恒温培养发现，5种典型林分表层土壤AWCD变化曲线均随着培养时间的延长呈现逐渐增加的趋势，与他人研究结果相似[10-11]。整个培养过程中，天然次生林土具有较高的AWCD值，说明天然次生林微生物活性较强；McIntosh均一性指数（U）与其他树种差异显著（P＜0.05），说明次生林土壤微生物具有较高的均一性。

主成分分析发现滨海沙土微生物利用的主要碳源为碳水化合物、氨基酸类、羧酸类等碳源，与李小容等[10]对海南岛木麻黄防护林土壤的研究结果类似。次生林土壤微生物在利用氨基酸类、胺类碳源方面与4种人工林分差异显著。已有研究发现森林植被演替顶级群落较早期群落具有较高的微生物多样性[7,29]。天然次生林的主要建群种潺槁木姜子是南亚热带季风常绿阔叶林的顶级种[30]，林下植被多样性丰富可能是造成较高的微生物活性和独特的碳源利用策略的主要原因。范垚城等[6]研究发现东北黑土天然次生林分以利用胺类为主，陈超凡等[31]研究发现地带性红壤林地上建群种土壤微生物以利用以氨基酸、羧酸类为主，翟辉等[22]研究发现黄土丘陵区土壤微生物以利用糖类、羧酸类、氨基酸类为主。由此可见，不同林分土壤微生物的碳利用策略是各异的。在母质条件、气候条件、海拔因素等外部条件相同的条件下，植被因素可能是影响土壤微生物功能多样性的主要因素。不同树种（尤其是针叶和阔叶树种）由于年凋落物、细根产量及质量，根系分泌物等存在显著差异[25]，森林树种结构的改变也可以显著改变地下生态系统微生物多样性[26]。Zhan feng Liu 等[27]研究认为不同植物种类生物量的差异可能导致土壤微生物群落结构及功能多样性；Beata Klimek等[28]发现针叶树种林分较阔叶林分具有较低的微生物活性和功能多样性指数，植被因子多样性与土壤微生物多样性有显著关系。本次研究的滨海沙地乔木植被除了天然次生林外，其他4种均为外来种（湿地松原产于美国，卷荚相思、木麻黄、桉树均原产于澳大利亚），以快速控制风沙灾害为主要目的，重点考虑树种的抗逆性、生长速度等，较少考虑树种对沙土的改良效果。Biolog-eco 微平板法利用土壤微生物代谢特定碳源产生的图谱特征分析微生物的功能特征，难以对土壤微生物的具体种类进行区分，后期将配合采用磷脂脂肪酸图谱分析法（PLFA）或基于DNA序列测定的方法进行深入研究，以进一步了解不同树种对特定细菌、真菌类型的影响。

3.2 滨海沙土微生物功能多样性与土壤理化性质相关性的关系

森林植被通过影响土壤理化性质间接影响微生物种类及功能[28]。植被对土壤理化性质的改良作用已有深入细致的研究，但究竟是由于植被先改良了土壤环境，进而刺激了微生物多样性，还是植被首先刺激了对环境敏感的微生物活性，而后推动土壤质量的持续改良，亦或是二者同时进行，尚未有明确的结论，有很多的不确定性[32]。相关性分析表明，滨海沙土土壤微生物功能多样性指数与土壤pH值、有效磷含量呈正相关，与Andruschkewitsch[33]及韩冬雪等[34]研究结果相似。主要原因在于滨海沙土酸性较强[35]，土壤淋溶强烈，不利于有机碳等养分物质的积累，且土壤普遍缺磷。通过理化性质分析可知，5种林分中仅次生林土壤pH值趋于中性，且具有较高的有效磷含量和土壤有机碳含量，AWCD值及多样性指数均较高，说明这3个因子可能是影响沙土微生物活性和功能多样性的主要因子。Simpson指数分析来看，尾巨桉与其他4种林分差异显著，可能与前期人工管理较为频繁，施肥、抚育力度较大有关。研究还发现土壤阳离子交换总量与交换性钾含量与微生物多样性指数呈正相关，与Brant等[36]研究结论相似，主要原因在于速效养分可以直接被微生物吸收，促进了微生物的生长和扩散。然而，也有与本研究结果不同的结论，如蔡进军等[4]发现微生物功能多样性指数与速效磷负相关，与pH值、速效钾无显著关系；宋贤冲等[37]研究发现微生物多样性指数Shannon指数与TOC、TN、AP、AK呈负相关。可能与滨海沙土成土时间较短，与地带性土壤相比，有机碳、AP含量偏低，有机碳、有效磷含量尚未达到满足微生物充分生长的水平，仍是制约微生物生长的主要因素。由于除木麻黄以外的林分样本数量总体较少，研究所选择的林分为相近林龄，未系统研究不同树种不同的生长发育阶段对土壤微生物的影响。

4 结 论

1）不同树种对沙土理化性质的影响存在显著差异（P＜0.05）。与人工林分相比，天然次生林土壤的有效磷、全碳、速效钾含量及阳离子交换量较高，而四种人工林分差异不明显。

2）与人工林相比，天然次生林土壤微生物具有较高的代谢活性和较独特的碳源利用方式；碳水化合物类、氨基酸类、胺类碳源是滨海沙土微生物利用的主要碳源类型。

3）土壤pH值、有效磷、有机碳含量与微生物功能多样性指数显著正相关。较低的有机碳、有效磷含量可能是限制滨海沙土微生物功能发挥的制约因素。在防护林更新改造过程中可通过套种乡土阔叶树种、增施磷肥等措施，调节土壤pH值，提高有机碳及有效磷含量，增强微生物活性，以促进沙土质量的持续改良。