南京椴嫩枝扦插生根过程中植物激素的变化

史锋厚 ，赵 瑞 ，罗 帅 ，郑 晨 ，沈永宝

（1.南京林业大学 林学院，江苏 南京 210037；2.南京林业大学南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；3.浙江省浦江县郑家坞镇政府，浙江 浦江 322206）

南京椴Tilia miquelianaMaxim.为我国特有椴树属树种，综合利用价值较高，曾广泛分布于我国华东地区，现种群数量急剧下降，其繁殖以种子繁殖和根蘖为主，但种子饱满度低且存在深休眠特性，根部萌蘖增殖系数不高[1]。扦插作为一种高效无性繁殖方法，可用于南京椴苗木繁殖，但椴树属树种多属于扦插难生根树种，使用IBA处理嫩枝插穗可促进生根[2-3]。本文以南京椴嫩枝插穗作为研究材料，以外源IBA生长调节剂处理插穗，对扦插生根过程中插穗中植物激素含量及相关激素间比值进行动态测定，探究南京椴嫩枝扦插生根过程中植物激素变化特点及其对生根的影响。

1 材料与方法

1.1 插穗制备

5月23日清晨，由南京林业大学天王苗圃基地内3 a生母树上采集半木质化枝条制作插穗，枝条采集、运输、制穗过程中注意保湿。枝条采后及时制备插穗，插穗长度10～15 cm，上切口平截，下切口斜切，插穗上部保留2片l/2叶。插穗基部使用0.5% KMnO4溶液洗脱5 min，减少插穗分泌的粘液对生根的影响。

1.2 扦插

扦插在南京林业大学玻璃温室扦插池中进行，温室内配有自动喷雾、遮阳和温控系统；扦插基质选用粒径3 mm珍珠岩，厚度约15～20 cm。扦插前5天使用50%多菌灵可溶性粉剂800倍液对基质进行喷洒消毒。扦插时，插穗基部使用1 000 mg·kg-1IBA粉剂处理，以未蘸取生根粉（IBA）处理作为对照，每处理50根，3次重复，另每处理扦插150根插穗用于取样测定激素含量。扦插株行距5 cm×10 cm，扦插深度约为插穗长度的2/3。

1.3 插后管理

扦插后压实插穗周边基质，并浇透水。根据气温、光照调节喷雾，以保持叶面湿润为宜，温室每天定时通风。待插穗生根后，逐渐减少喷雾量和增加光照。扦插后每隔7 d，使用50 %多菌灵可溶性粉剂800倍液喷洒插穗和基质。

1.4 指标测定

扦插后每隔10 d取样一次，每次取10根插穗（插穗明显死亡的不取样），共取5次。将插穗清洗干净后，迅速刮取插穗基部2～3 cm韧皮部约5 g左右，剪碎放至-69 ℃超低温冰箱中保存备用。植物激素测定采用酶联免疫吸附法（ELISA）[4]。扦插后50 d，将各处理插穗取出，统计插穗生根率、腐烂率、生根数及平均根长、平均根粗等指标。

1.5 数据统计分析

采用Mircrosoft Excel 2007分析数据并绘制指标变化图，采用SPSS13.0软件进行方差分析和Duncan多重对比。

2 结果与分析

2.1 IBA处理对南京椴嫩枝插穗扦插生根的影响

南京椴嫩枝插穗经1 000 mg·kg-1IBA粉剂处理后，插穗生根率接近67 %，极显著高于对照（CK），不定根生根数、不定根长和插穗腐烂率的控制均优于对照处理（表1），说明使用1 000 mg·kg-1IBA粉剂处理可以显著促进嫩枝插穗生根，提高插穗生根质量并降低插穗腐烂率。

表1 南京椴嫩枝插穗扦插生根统计结果†Table 1 Statistical results of cuttage rooting and twig cutting of T.miqueliana

经1 000 mg·kg-1IBA粉剂处理，插穗扦插5 d时，个别插穗开始出现少量透明状肿大，形成愈伤组织。扦插10 d时，部分插穗下切口形成晶莹透明的环带状愈伤组织，未被愈伤包裹的插穗基部变为黑色，插穗基部皮孔颜色开始变深并出现白色小突起。扦插20 d时，大多数插穗基部被愈伤组织完全包裹，部分插穗长出白色嫩根。扦插30 d时，多数未腐烂插穗萌生出幼嫩的白色不定根，大部分不定根由插穗切口处萌出，少量由愈伤组织团长出；由切口处长出的不定根相对粗壮，而由愈伤组织处长出的嫩根较柔弱；部分基部腐烂的插穗会产生高位不定根，但数量有限。扦插40 d时，已生根插穗的不定根数量继续增多，不定根由白色开始变黄并陆续出现侧根；一些完全被愈伤组织包裹的插穗虽未腐烂，甚至展出新叶，但仍无生根迹象。

椴树属树木插穗多无潜伏根原基，扦插生根过程中诱导形成根原基[2]，推断南京椴亦应属于诱导根原基型，根据插穗生根形态观察，可将其扦插生根过程划分为愈伤组织形成期、根原基诱导期、不定根形成期和不定根生长期，大致对应于扦插后0～10 d、10～20 d、20～30 d和30～40 d。

2.2 南京椴扦插生根过程中插穗植物激素含量动态变化

南京椴嫩枝扦插生根过程中，经IBA处理的插穗与对照组插穗皮部IAA含量、ZR含量、GA3含量和ABA含量变化，分别见图1—4。

2.2.1 扦插生根过程中插穗皮部IAA含量变化

枝扦插生根过程中，插穗皮部IAA含量变化如图1所示。经IBA处理和对照组插穗在生根过程中，插穗皮部IAA含量均呈现“升高-降低”的变化趋势，IAA含量峰值均出现在扦插后20 d，该时间节点正处于根原基诱导与不定根形成过渡期；插穗IAA含量到达峰值后，经IBA处理的插穗内IAA含量仍然维持在较高水平，直至不定根生长期开始下降。上述分析说明，经IBA处理的插穗皮部IAA含量始终高于对照组插穗，分析原因在于外源IBA处理插穗后可在插穗内部转变为IAA，插穗内IAA含量的升高有利于根原基的诱导和不定根的发生，IAA促进扦插生根的作用机理恰是促进了根原基的诱导和不定根的发生；不定根生长期需要消耗更多的IAA，使得插穗内IAA含量有所降低。

2.2.2 扦插生根过程中插穗皮部ZR含量变化

图1 插穗皮部IAA含量变化Fig.1 Changes of IAA contents in the bark of cutting

南京椴嫩枝扦插生根过程中，插穗皮部ZR含量变化如图2所示。扦插生根过程中，经IBA处理插穗与对照组插穗皮部ZR含量变化趋势相似，即前期下降较快，后期变化相对平缓，且对照处理变化相对滞后于IBA处理组。经IBA处理的插穗皮部ZR在愈伤组织形成期便降至较低含量，并在根原基诱导期处于较低水平，至不定根发生和生长期再度升高。与对照相比，IBA处理插穗ZR含量在根原基诱导期处于较低水平，说明低浓度ZR有利于根原基的诱导；IBA处理后，可阻碍插穗内ZR的合成或促使代谢加快，使其维持较低水平，有利于插穗生根；不定根发生和生长期，插穗内ZR含量略微升高，说明这两个时期细胞分裂增多，需要ZR的参与。

图2 插穗皮部ZR含量变化Fig.2 Changes of ZR contents in the bark of cutting

2.2.3 扦插生根过程中插穗皮部GA3含量变化

南京椴嫩枝扦插生根过程中，插穗皮部GA3含量变化，如图3所示。在插穗生根过程中，IBA处理和对照插穗皮部的GA3含量变化趋势相似，均呈双峰曲线，经IBA处理的插穗GA3含量在扦插后20 d降至最低点。但经IBA处理的插穗皮部GA3在插穗生根过程中始终低于对照，尤其在扦插后20 d时，低于对照55.8 %，此阶段正是插穗根原基诱导及不定根形成的关键时期。南京椴插穗在根原基诱导与不定根形成过渡期，插穗内GA3含量降至最低点，表明低浓度GA3有利于插穗不定根的发生和形成，而IBA处理有利于降低插穗内GA3含量，促进插穗生根。

2.2.4 扦插生根过程中插穗皮部ABA含量变化

南京椴嫩枝扦插生根过程中，插穗皮部ABA含量变化，如图4所示。经IBA处理的插穗ABA含量在愈伤组织诱导期处于较稳定水平，但在根原基诱导期和不定根形成期阶段，插穗ABA含量基本呈下降趋势；在扦插生根的整个过程中，经IBA处理的插穗ABA含量均低于对照。南京椴扦插生根过程中，尤其在根原基诱导期和不定根形成期，插穗内ABA含量均呈下降趋势，且经IBA处理的插穗内ABA的含量处于较低水平，说明低浓度ABA有利于插穗根原基的诱导和不定根的发生；IBA处理可使插穗内ABA含量降低，消除或降低阻碍插穗生根的因素，有利于促进插穗生根。

图3 插穗皮部GA3含量变化Fig.3 Changes of GA3 contents in the bark of cutting

图4 插穗皮部ABA含量变化Fig.4 Changes of ABA contents in the bark of cutting

2.3 南京椴扦插生根过程中插穗植物激素比值动态变化

南京椴嫩枝扦插生根过程中，经IBA处理的插穗和对照插穗皮部IAA/ABA和IAA/ZR比值变化分别，见图5和图6。

2.3.1 扦插生根过程中插穗皮部IAA/ABA变化

由图5可知，经IBA处理的插穗扦插后，插穗IAA/ABA比值基本呈直线上升趋势，至30 d时达到峰值，而后下降；对照插穗皮部IAA/ABA比值变化较为平缓，且始终低于IBA处理组。在不定根生长期，IBA处理组和对照组插穗皮部IAA/ABA比值均呈现下降趋势。经IBA处理的插穗，在愈伤组织形成期、根原基诱导期和不定根形成期，IAA/ABA比值始终升高，而对照插穗该比值却维持较稳定的水平，说明IBA处理有利于提高IAA/ABA比值，有利于促进插穗生根；结合插穗中IAA和ABA含量变化，IBA处理有利于提高插穗中IAA含量和降低ABA含量，促使IAA/ABA比值在愈伤组织形成期、根原基诱导期和不定根形成期始终处于持续升高的趋势；插穗不定根生长期，IAA/ABA下降，说明其与不定根生长的关系不紧密。

图5 插穗皮部IAA/ABA比值变化Fig.5 Changes of IAA/ABA ratio in the bark of cutting

2.3.2 扦插生根过程中插穗皮部IAA/ZR变化

由图6可知，经IBA处理的插穗扦插后，插穗皮部IAA/ZR比值在前20 d呈升高趋势、在后20 d呈下降趋势，即在愈伤组织形成期和根原基诱导期升高、在不定根形成期和不定根生长期降低；对照组IAA/ZR比值变化趋势与IBA处理组相似；与对照相比，IBA处理插穗皮部IAA/ZR比值在愈伤组织形成期和根原基诱导期变化幅度更大且明显高于对照。上述分析说明，扦插过程中尤其在愈伤组织形成期和根原基诱导期，IAA/ZR比值呈现升高的变化趋势有利于扦插生根，IBA处理插穗促进生根的原因在于提高IAA含量并降低ZR含量，提高IAA/ZR比值。

图6 插穗皮部IAA/ZR比值变化Fig.6 Changes of IAA/ZR ratio in the bark of cutting

3 讨 论

3.1 插穗IAA含量变化与插穗生根的关系

扦插繁殖过程中，不定根的形成受制于多种因素，但生长素在不定根形成过程中起关键作用，高红滨甚至认为扦插生根的难易主要取决于内源IAA的含量[5]。IAA促进生根的作用机理主要为其作用于非常敏感的形成层等幼嫩部位的分生组织细胞，引起细胞分化和分裂，形成根原始细胞，影响再生初期蛋白质合成的数量和质量[6]。同时，IAA促进韧皮射线细胞、皮层薄壁细胞等脱分化产生愈伤组织。因此，生产中常采用可刺激插穗内部形成IAA的IBA、NAA等生长调节剂处理插穗以促进生根。

南京椴嫩枝插穗在生根过程中，IBA处理与对照插穗内IAA含量大致经历了“升高—降低”的变化趋势。本实验证实，使用IBA处理插穗可以促进IAA的生成，且IAA含量在扦插20 d时达到峰值，该时期正值根原基诱导期，说明IBA处理有助于根原基和不定根的诱导，这与王文凤等、郑先武等研究结论一致[7-8]。不定根形成时期（20～30 d），根系发育需要较多IAA，理论上IAA含量应下降，但由于IBA处理刺激了根原基生长点细胞的活性，诱导产生IAA，使得IAA含量处于相对稳定的水平。对照插穗由于缺乏IBA刺激作用，插穗IAA含量始终低于IBA处理插穗，这正是对照组插穗生根率和生根质量不佳的主要原因。

3.2 插穗ZR含量变化与插穗生根的关系

细胞分裂素对插穗生根具有影响作用，主要抑制根原基的分化和形成[9]；施用外源生长素可以促进插穗ZR代谢，降低其含量，有利于插穗生根[10]。

南京椴嫩枝扦插生根过程中，插穗ZR含量由开始扦插阶段的快速下降之后维持较低水平，证实插穗ZR含量低有利于根原基的分化形成；使用IBA处理的插穗中ZR含量下降速度更快，表明外源生长素具有促进ZR代谢的作用，导致插穗中ZR含量下降，这与朱青松等研究结论相符合[10]。扦插后期，即不定根伸长期，插穗ZR含量开始缓慢升高，说明高浓度ZR对不定根的生长具有促进作用，这恰是该时期插穗根系生长旺盛的原因之一。

3.3 插穗GA3含量变化与插穗生根的关系

现有文献报道，降低赤霉素含量有助于刺激插穗不定根的形成[11]，外施赤霉素明显抑制插穗生根，原因在于赤霉素具有阻碍生长素诱导根原基发育的作用[12]。

本研究发现，南京椴嫩枝扦插生根过程中，插穗GA3含量分别在愈伤组织诱导期和不定根形成期出现峰值，表明GA3参与了愈伤组织的诱导和不定根的形成，且较高浓度的GA3有利于愈伤组织和不定根的诱导，这与刘桂丰等研究结论相符[13]。愈伤组织诱导期和不定根形成期是插穗新陈代谢相对旺盛、细胞分裂活跃的时期，需要赤霉素发挥作用，这也证实了关于赤霉素类物质较多地存在于生长旺盛部位的结论[14]。本实验中，插穗中GA3含量在根原基诱导期呈现降低趋势并达到低点，说明GA3含量降低有利于诱导形成根原基，这与蒙海涛等的研究结论相符[11]。

3.4 插穗ABA含量变化与插穗生根的关系

插穗中ABA含量高不利于生根的结论已获得公认，ABA通过抑制插穗潜伏根原基的分化而抑制插穗生根，并降低生根率[7,15-16]。

南京椴嫩枝扦插过程中，插穗ABA含量基本保持下降的趋势，且IBA处理组插穗ABA含量明显低于对照，说明使用IBA处理可以抑制插穗中ABA合成，ABA含量降低有利于插穗生根。扦插初期，ABA含量略微升高是由于制穗过程中的机械损伤所引起；经IBA处理的插穗ABA峰值出现时间比对照迟约10 d，说明外源IBA可以抑制插穗内ABA合成，有利于促进插穗生根，提高插穗生根率，这与胡虹等的研究结论相符合[17]。

3.5 插穗IAA/ABA、IAA/ZR比值变化与插穗生根的关系

激素影响插穗生根不仅与各类激素含量有关，还与激素间比值有关，甚至相关激素间比值在决定扦插生根过程中的作用更为明显和重要，但不同树种对于激素间比值的反应敏感度并不相同[18]。现有文献指出，IAA/ABA与扦插生根的关系更为密切，且相较于IAA和ABA含量与插穗生根的关系更具有说服力，IAA/ABA可作为评价插穗扦插生根难易的重要指标[15-16,19]；一般认为，IAA/ABA高，插穗生根能力较强[20]，插穗中IAA含量高且ABA含量较低有利于根原基的诱导，反之则抑制根原基的形成[21]。

南京椴嫩枝扦插愈伤组织形成期、根原基诱导期和不定根形成期，IAA/ABA不断升高，并在不定根产生时达到最大值，插穗中IAA和ABA含量发生巨大变化的时期均处在不定根形成期，说明IAA/ABA比值高时有利于不定根的诱导与发生，这与程水源等研究结论相符合[22]。在此期间，IAA含量保持不断上升的态势，而ABA含量呈现减小趋势，这与愈伤组织和不定根的形成有密切联系；随着不定根的不断伸长，IAA/ABA比值才开始明显下降，主要与IAA含量下降、ABA含量上升有关。本实验中，外源IBA处理的南京椴插穗IAA/ABA比值均显著高于对照，说明IBA可以调节插穗中IAA与ABA含量，并提高生根率。

现有文献报道，IAA/ZR同样对扦插生根产生影响作用[23]。本实验中，IAA/ZR与IAA/ABA值的变化趋势相似，IBA处理的插穗IAA/ZR明显高于对照，并在诱导生根过程中呈不断升高的趋势，至后期不定根大量形成期，比值趋于稳定。经IBA处理的插穗IAA/ZR升高且明显高于对照，说明IAA/ZR升高有利于根原基的诱导与不定根的生成，这与肖关丽等的研究结论一致[23]。

4 结 论

南京椴为扦插较难生根树种，经IBA处理的嫩枝插穗扦插生根率可达67%，证实IBA处理对于扦插较难生根树种的促根效果明显。植物激素作为生长调节物质，对于树木生长发育具有重要影响，同样影响树木的扦插生根过程。南京椴嫩枝扦插过程中，IAA对于插穗根原基的诱导和不定根的发生具有较为直接的影响作用，其含量升高有利于扦插生根；GA3含量增加有利于根原基形成，而低水平GA3则更有利于不定根的生长；ABA和ZR含量升高不利于插穗生根，表现为抑制根原基的诱导和不定根的发生；IAA/ABA相比IAA/ZR与诱导生根关系更为密切，IAA/ABA变化与插穗中IAA与ABA含量之间此消彼长的动态变化有关，且呈现出与生根情况相符的变化规律，说明IAA、ABA在插穗根原基诱导和不定根形成过程中有一定的协调作用，插穗生根主要是由这两种激素的平衡状态来调控的，IAA/ABA可以作为衡量南京椴嫩枝扦插生根能力的指标。使用外源IBA粉剂处理南京椴嫩枝插穗有利于扦插生根的原因与插穗中激素含量以及激素间比值变化具有密切关系，外源IBA处理可以促进插穗内IAA含量升高，调节ABA、ZR、GA3含量降低，促使IAA/ABA在诱导生根期快速增大，通过相关激素的调控，使插穗向有利于促进生根的生理状态转变。