隐孢子虫病实验室诊断技术研究进展

田格如， 吴礼平， 郝春燕， 薛增迪

(杨凌职业技术学院， 陕西 杨凌 712100)

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种由隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)感染所引起的人和动物产生持久或慢性腹泻的主要原虫病，能表现严重的发病率和死亡率。此外，隐孢子虫也是一种引起食源性或水源性疾病暴发的重要病原体之一，主要与再生水场所或饮用水的污染有关[1]。特别是在发展中国家，隐孢子虫病被认为是一种引起营养不良儿童腹泻或过早死亡的重要原因。有关从非洲和亚洲国家抽取22500名儿童(<5 y)的流行病学调查结果表明：隐孢子虫是一种主要引起12～23月龄婴儿严重腹泻和增加死亡风险的四种最常见的病原体之一[2]。隐孢子虫病已被列入引起人类最常见的6种腹泻疾病之一，并被世界卫生组织(WHO)列为艾滋病的怀疑指标之一[3]。

目前，隐孢子虫的有效种被认为有30个[4]。感染人的隐孢子虫种主要是人隐孢子虫(Cryptosporidiumhominis)和微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)，前者只感染人，而后者是人兽共患的[4]。此外，还有一些其他的隐孢子虫种，例如：鼠隐孢子虫(Cryptosporidiummuris)、火鸡隐孢子虫(Cryptosporidiummeleagridis)、犬隐孢子虫(Cryptosporidiumcani)和猫隐孢子虫(Cryptosporidiumfelis)，通常很少感染人类[4]。人主要是通过摄入卵囊而感染，潜伏期一般是2 d～2 w，且症状可持续数天至数月。最常用的检测样本是粪便，有时也可用小肠内容物、活检或组织样品。由于卵囊是间歇性排出的，因此隔日采集样品是比较理想的。隐孢子虫已被列为二级生物安全微生物，因此应在安全室内处理样品[5]。

目前，有很多技术用于隐孢子虫病的诊断，包括显微镜检查、改良抗酸染色法或荧光染色法，可用免疫学方法检测抗原和抗体，也可用活检的组织学检查或检测DNA的分子学方法。

1 病原学诊断

1.1 湿片镜检

既可在新鲜的粪便样品中，也可在保存的粪便样品中检测隐孢子虫，若样品要长期储存，应保存于10%福尔马林、醋酸钠福尔马林或聚乙烯醇中。然而，保存于聚乙烯醇的样品不适合用染色方法诊断，而保存于福尔马林的样品不适合用分子学方法诊断。虽然卵囊可以用光学显微镜或相差显微镜检查，但是由于一些卵囊未被染色而出现漏检。通过减少粪便中的残渣，可以提高显微镜检查的灵敏度。常用的方法有离心法、饱和蔗糖溶液漂浮法、饱和盐水漂浮法和改良的甲醛乙醚法[6]，而改良的甲醛乙醚法由于其高灵敏性而得到更广泛的应用。为了更好地回收隐孢子虫卵囊，建议提高离心速度为1200×g；然而，如果同样的样品用于检查包括蠕虫在内的其他寄生虫，离心速度不能高于750×g，否则可能导致蠕虫虫卵破裂。在这种情况下，如果重复出现阴性结果，对临床和流行病学方法的质疑就会更多。免疫磁性分离法是一种既昂贵又耗时的选择[5]。利用该技术，可以将暴露在卵囊表面上的表位黏附在含有单克隆抗体(mAbs)的磁珠上。当复合物被吸到试管的一侧时，磁珠-卵囊复合物在磁力的作用下被浓缩在一起；随后，吸入悬浮液，并加入酸性溶液以释放浓缩和纯化的卵囊。

1.2 染色镜检

由于隐孢子虫很小，使得在粪便中检测成为一种挑战。为了克服这个困难，文献中讲述了多种染色技术及其改进方法。吉姆萨染色法和詹纳染色法首次用于鉴别卵囊。卵囊呈半透明状，周围有窄而清晰的光晕，用蓝色染液染色后，出现红色或紫色的嗜酸性颗粒。虽然该方法操作简单，但是缺乏敏感性和特异性。在1981年，Henriksen 和 Pohlenz用萋-尼氏染色法检查卵囊，之后Casemore等人将其方法进行改良后得到更好的结果，被广泛用于卵囊的检测[7]。在显微镜下卵囊呈红色圆形，且每个卵囊的染色程度不同，可能与粪便残渣、酵母细胞和细菌孢子等不同的结构染色太红有关[8]。此外，只有孢子体和残余体等卵囊的内部结构是红色的，而空卵囊则保持不变，从而降低了其敏感性[9]。各种研究表明：金胺-酚染色法可以作为改良抗酸染色法的替代方法[9,10]。与改良抗酸染色法相比较，操作简便且更敏感[10]。由于金胺-酚染色法的高灵敏度和特异性，被很多实验室认为是诊断的“金标准”[10]。用金胺-酚或抗酸染色的涂片有一个优点，即染色的卵囊可以从载玻片上刮下来，然后提取DNA进行物种分析[11]。未浓缩的粪便样品用显微镜的检测范围是1×104～5×104个卵囊，而浓缩的样品其灵敏度可以增加10倍[5]。

2 免疫学诊断

免疫学方法主要用于检测抗原或抗体。抗原检测试验用于急性感染的诊断，而抗体检测试验用于血清流行病学调查。

2.1 抗原检测方法

2.1.1 荧光标记抗体检测 利用单克隆抗体检测隐孢子虫的卵囊壁抗原。这些单克隆抗体主要用于识别卵囊表面的表位。大多数商用单克隆抗体主要是针对微小隐孢子虫的，对于人致病性或动物致病性的隐孢子虫特异性表位目前尚无抗体制备。由于隐孢子虫属的不同种或基因型的卵囊表位表达上的差异会使荧光减弱，因此，还需用常规方法或聚合酶链式反应(PCR)对阴性样品进行确认[5]。

2.1.2 酶标记抗体检测 基于酶标记抗体的抗原检测试剂盒主要有酶免疫分析(EIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)和免疫色谱(IC)分析。据报道，用ELISA试剂盒检测粪便中的抗原，其检测值可达3×105～1×106个卵囊，与显微镜的检测值相似。然而，根据试剂盒中使用的抗体，在某种情况下其灵敏度较低，但特异性可达98%～100%，并可在短时间内加工大量样品[12-14]。IC分析是实验室广泛流行的一种方法，它以其快速检测结果而闻名。虽然特异性高(98%～100%)，但敏感性较低[6]。EIA和IC试剂盒可用于单个病原体的检测，也可用于与贾第鞭毛虫或溶组织内阿米巴结合的检测。这些试验适用于新鲜、冷冻或保存于福尔马林中的样品，且具有耗时短和同时检测多个病原体的优点。

2.2 抗体检测方法

针对血清、唾液或粪便样品中隐孢子虫特异性抗原的抗体检测方法是一种间接的诊断方法。特异性循环抗体的检测只有在血清转化、效价升高或抗体同型转换的情况下才有意义。如果没有这些情况，抗体的存在只能反映当前感染或接触过抗原，而这是毫无意义的。因此，这些试验主要用于本病的血清流行病学调查。

感染隐孢子虫后，子孢子表面的27kDa和15/17kDa抗原就会产生血清抗体。利用隐孢子虫的天然抗原或重组抗原检测抗体有多种形式。最初使用C. parvum粗提取物发现酶联免疫吸附分析比电免疫转移印迹法特异性低，而现在使用隐孢子虫重组抗原提高了其特异性。ELISA试验在多种重组蛋白的研究中显示出良好的效果。有关报道表明，一种重组23kDa抗原(CP23)与天然27kDa抗原相比较，其ELISA试验结果相当。据报道，CP23抗体与既往感染有关，而CP17抗体则表明当前感染[15]。Kjos等用重组rCP41(在大肠杆菌中克隆表达)检测人的阳性血清[16]。CP23(C. parvum 27kDa重组抗原)已被用于确定纵向感染的趋势[17]和不同年龄段的血清流行病学调查[18]。

3 组织学诊断

先前的研究表明，根据肠道粘膜活检中隐孢子虫不同阶段的组织学变化可以诊断人隐孢子虫病。组织切片可以用于肠粘膜刷状缘隐孢子虫的检测，呈小的嗜碱性球形结构，大小为3～5 μm，排列成行或成簇。组织切片不需要特殊染色就可以筛查，也可以对石蜡包埋的组织切片进行PCR或免疫组化分析[19]。然而，由于其步骤繁琐和样品需谨慎处理等诸多缺点，目前很少使用。此外，这也是一种既昂贵又耗时的方法，不适合常规诊断。

4 分子学诊断

4.1 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)

常用的核酸检测方法有限制性片段长度多态性PCR(PCR-RFLP)、多重等位基因特异性PCR(MAS-PCR)和实时定量PCR。用于隐孢子虫种鉴定的基因有18S rRNA、TRAP C1、COWP、Hsp 70和 DHFR。用于亚型的检测可使用一些分型工具，如糖蛋白(gp)60基因、小卫星和微卫星标记。

基于小亚基rRNA的 PCR-RFLP巢式分析法可检测大多数常见的致病性隐孢子虫种，其中外部引物长度为1 325 bp，内部引物长度为826 bp。这是检测样本中少量卵囊(<100)的首选方法，因此，这也是全球大多数实验室已经证实的最流行的一种方法。基于二氢叶酸还原酶基因序列的MAS-PCR可检测出人隐孢子虫(357 bp)和微小隐孢子虫(190 bp)[20]。因此，在人类暴发隐孢子虫病的情况下，它可能是一个很有价值的诊断工具。

近年来，用实时定量PCR检测隐孢子虫的报道很多，可以利用18S rRNA基因的遗传多态性来鉴定。它不但可以提高诊断灵敏度，还可以提高检测速度以及进行定性分析。它的主要优势是可以定量评估环境中的污染程度，且封闭系统模式也减少了污染。最近，一种新的实时定量PCR试验已被报道，用改进的基因组分析端粒CHOS-1基因来鉴定人隐孢子虫和微小隐孢子虫的亚区[21]。

4.2 腹泻病原体多重检测试剂盒(Gastrointestinal Pathogen Panel, GPP)

GPP试剂盒可同时检测一个样本中引起腹泻的多种细菌、病毒及寄生虫，是第一个可以同时检测17种主要肠胃道病菌的商品化试剂盒。包括11种细菌(空肠弯曲菌、沙门氏菌、志贺氏菌、肠产毒性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌、产志贺毒素大肠埃希菌、大肠杆菌O157:H7、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和艰难梭菌毒素A/B)、3种寄生虫(蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫和痢疾变形虫)以及3种病毒(诺如病毒GI/GII、腺病毒40/41和轮状病毒A)[22]。它的优点是可同时检测一个样本中的多个病原体，且节省成本和人力。

4.3 环介导等温扩增技术(Loop -mediated Isothermal Amplification, LAMP)

该方法由于操作简单，且特异性强，已成为许多生物体的实用诊断工具。因此，2007年，在怀疑隐孢子虫病发生的情况下，首次用LAMP对一些粪便样本进行了评估[23]。用于LAMP的引物组来自于C. parvum的gp60基因(60kDa)，可以扩增出189bp的产物。研究表明：LAMP是一种很有用的诊断工具。在一项研究中，将三种LAMP试验(SAM-1, HSP和gp60)与巢式PCR检测粪便样品进行比较，结果表明：LAMP的灵敏度高于巢式PCR，被认为是一种有效的流行病学检测工具[24,25]。

目前，对于隐孢子虫病的诊断还面临着许多技术和实践上的挑战。此外，由于隐孢子虫不能持久进行人工培养，也没有合适的实验动物模型，难以对其进行详细研究。到目前为止，我们既没有有效的治疗方法，也没有有效预防隐孢子虫病的疫苗。只有硝唑尼特是食品药品监督管理局批准的，并已被证实对于免疫功能正常的宿主是有效的。因此，预防或早期诊断是控制其感染的最佳策略。