miR-222及其靶基因BBC3在肝细胞癌组织中的表达及其相关性

刘志春 党存曙 刘 彬 孙景武 赵梦杰

肝癌是临床上常见的消化道肿瘤，由于其较高的发病率和高死亡率成为研究热点。近年来研究发现microRNA与肝癌的发生和发展有密切相关。microRNA是一22 nt大小的非编码RNA，其可以抑制靶基因的表达。作为 microRNA家族中的一员，研究发现miR-222在多种肿瘤细胞中都有表达，并且会影响患者的预后。BBC3基因也叫PUMA基因，是一种受p53 基因上调表达的凋亡调控蛋白，在肿瘤中具有重要的作用。研究发现BBC3是一种促凋亡基因[1-2]，因其可以被P53快速诱导并有较强的促凋亡作用而命名。研究发现，BBC3基因是一种p53的下游基因，在p53依赖和非依赖2种凋亡途径过程中均有重要的作用。近几年，BBC3基因的研究成为医学工作者的热点，大量的研究表明，BBC3基因与机体肝癌、直肠癌以及乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生有关[3-5]。本研究通过检测 miR-222 及其靶基因 BBC3 在肝癌及癌旁组织中的表达水平，探讨其在肝癌患者组织中表达的相关性，从而为mir-222 作为潜在肝癌治疗诊断的新型分子靶点提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择我院普外科在2013年10月至2017年12月确诊的肝细胞癌患者70例，其中男性55例，女性15例，年龄34～71岁，平均年龄(51.3±9.3)岁。取肝癌患者癌及癌周组织，其中Ⅰa期患者21例，Ⅰb期14例，Ⅱa期29例，Ⅱb期6例。所有患者均经二名病理学专家再次确认，所有病例术前未经化疗和放疗。正常对照组20例肝脏组织取自24 h内意外死亡者，其中男性11例，女性9例，年龄26～42岁，平均年龄(35.6±6.5)岁。肝癌组织、癌周组织以及癌灶5 cm外正常肝组织的获得均征得患者或家属的同意授权，并且签署患者知情同意书，本项实验研究通过了中国石油天然气集团公司中心医院伦理委员会的审理和批准。

纳入和排除标准：①通过病理组织学检查明确诊断为肝癌的患者；②术前7 d内完整的实验室及影像检查资料。正常对照组死亡原因均排除肿瘤和其它重大疾病。

1.2 方法

1.2.1 试剂和材料 总RNA快速提取试剂盒购自Generay生物公司；逆转录试剂盒购自MBI Fermentas公司；DMEM培养基及胰酶购自Hyclone公司；兔抗人BBC3多克隆抗体购自美国IBL公司；EnvisionTM两步法免疫组化试剂盒购自Thermo Fisher公司；10%正常山羊血清购自杭州四季青公司；0.01 M枸橼酸盐缓冲液、PBS缓冲液、Harris苏木精液均购自OXIOD公司；中性树胶、二甲苯购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2.2 肝癌组织总RNA的提取 在无菌环境下取得肝脏组织，把其放入液氮冷却的研钵中，加液氮进行研磨成均匀的粉末，加入1 ml的Trizol试剂混合并摇匀后转移到离心管中，加入0.2 ml的氯仿混合均匀，静置2～3 min，以12 000 r/min，4 ℃离心15 min，弃上清液；加入75%乙醇溶液进行洗涤，收集离心管内的溶液即为组织的总RNA；利用紫外分光光度计测定RNA的浓度，光密度值大于1.8的样品进行后续试验。

1.2.3 RT-PCR检测miR-222基因 逆转录反应：采用mi-RNA逆转录试剂盒进行逆转录。反应体系为：1.0 μl 的50 U/μl MultiScribeTMReverse Transcriptase，3 μl 的1 μmol/L逆转录特异性引物，0.19 μl的20 U/μl RNA 酶抑制剂，0.15 μl的100 mmol/L dNTPs，1 μl的RNA模板，1.5 μl 10 ×RT buffer，加超纯水补足20 μl。反应条件：16 ℃，30 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 sec；产物放置-20 ℃冰箱保存备用。

Taqman real-Time PCR：应用microRNA Real-Time 试剂盒对产物进行PCR扩增，反应体系：10 μl的TaqMan GEx MASTER Mix，1 μl的realtime 特异性引物，1 μl的RT产物，用超纯水补足20 μl。反应条件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 sec；60 ℃，1 min，共40个循环；

miR-222 RNA表达水平的计算：以U6作为内参，测定Ct 值并计算△Ct值，△Ct = miR-222 Ct值-U6 Ct值，以2-△△CT的值作为miR-222RNA的相对表达量[6]。

1.2.4 免疫组织化学染色 利用EnvisionTM免疫组化试剂盒的说明书进行操作。把3组不同部位的组织进行切片，厚度均为44 μm，进行烤片并脱蜡水化，加入枸橼酸盐缓冲液后加热20 min，对抗原进行修复。在室温冷却后，用PBS洗涤3 min，加入1∶25 稀释的兔抗人BBC3多克隆抗体，放4 ℃冰箱过夜；PBS洗涤3 min，加入1∶100 稀释的抗兔IgG在室温孵育30 min，PBS洗涤3 min；采用DAB 显色，苏木精衬染以及用中性树胶封片，在电子显微镜下观察实验结果。阴性对照组用PBS代替一抗。

1.2.5 结果判定 BB3在细胞内表达呈现棕黄色或棕褐色，其主要在细胞质内表达，在部分细胞核内也有表达。按照Max[7]的方法对BBC3的表达结果进行判定：在400倍显微镜下每张切片选取3个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞平均百分率。阳性细胞概率判定方法为细胞染色轻度和阳性细胞染色得分的乘积。染色强度积分：不染色为0分，轻度染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分；染色强度积分：不染色为0分，细胞染色≤25%为1分，细胞染色>25%～50%为2分，细胞染色>50%～75%为3分，细胞染色>75%为4分。两者积分<2分为阴性，≥2分均可判断为阳性。阳性2～3分为(+)，4～5分为(++)，6～7 分为(+++)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 肝癌患者miR-222 RNA表达水平

RT-PCR 结果显示，miR-222 RNA表达水平在肝癌患者肝癌组织(10.85±1.85)和癌旁组织(1.94±1.13)明显高于正常对照组(0.36±0.25)，两两比较，差异均有统计学意义(F=3.546，P<0.05)。而肝癌组织miR-222 RNA表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义(t=4.317，P<0.05)，肝癌组与正常对照组比较(t=5.321，P<0.05)；癌旁组与正常对照组比较(t=0.632，P<0.05)。

2.2 BBC3蛋白在肝癌组织细胞中的表达

BBC3 阳性染色主要在细胞质内表达，部分细胞核内也有表达，呈棕黄色颗粒。70 例肝癌组织中，BBC3 阳性表达25 例，阳性表达率为35.71%；70 例肝癌癌旁组织中，BBC3 阳性表达37 例，阳性表达率为52.86%；20例正常肝组织中，BBC3阳性表达16例，阳性表达率为80.00%。BBC3 在正常肝组织、癌旁组织及肝癌中阳性表达率依次降低。见表1。

表1 BBC3蛋白免疫组化检测结果/例

注：BBC3阳性表达率①肝癌组与正常对照组比较，t=4.361，P<0.05；②癌旁组与正常对照组比较，t=3.587，P<0.05；③肝癌组与癌旁组比较，t=0.689，P<0.05。

2.3 miRNA-222与BBC3蛋白表达水平相关性分析

肝癌组miRNA-222与BBC3蛋白的表达水平进行supearman相关分析，miRNA-222相关系数γ=-0.497、P=0.01，提示miRNA-222与BBC蛋白表达水平显著负相关；癌周组miRNA-222相关系数γ=-0.119、P=0.065，癌周组无统计学相关关系。

3 讨论

肝细胞癌是最常见恶性肿瘤之一，占恶性肿瘤致死患者人数第3位，肝癌的发病机制复杂，涉及到多基因、多阶段的异常改变，肝癌发生的详细分子机制仍不明确[8]。

miRNA 是一种广泛存在于人体组织和细胞中的非编码调控小RNA。近几年的研究发现，miRNA 对肿瘤的发生和发展起着非常重要的作用，miRNA的存在、缺失和表达水平变化均会对细胞的选择和分化产生影响[9]。以前的研究表明，miR-222在肝癌组织中有异常的高表达，且对患者的病情和预后产生影响。miR-222是miR-221/222家族的一员，其定位于X染色体p11.3区域内大小约为1 kb。另外研究表明，miR-222在宫颈癌、肝癌、结肠癌以及乳腺癌等多种恶性肿瘤组织和细胞中有高表达，通过调控下游靶基因c-kit、p57、p27、Bim以及Bmf的表达，从而改变细胞增殖和凋亡过程，影响肿瘤的发生和发展[10-11]。

BBC3即p53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)基因，是2001年新发现的Bcl-2蛋白家族中BH3亚家族成员，定位在线粒体外膜，是p53作用的下游靶基因。BBC3基因具有强大的促凋亡作用并且能被快速诱导[12-13]。近年来，BBC3已成为医学研究的热点，许多研究表明，BBC3 与结直肠癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展息息相关[5,14-15]。本实验研究结果显示BBC3在肝癌组织、癌旁组织以及正常肝组织中均有表达，BBC3蛋白表达在同一患者的肝癌组织、癌旁组织之间无差异统计学意义，正常肝组织与癌组织、癌旁组织之间比较，差异有统计学意义。初步推论BBC3在一定的条件下可以促进细胞的凋亡。但是BBC3在肝癌组织中的表达水平与肝癌的发生、发展的关系还有待进一步的研究。

本试验结果表明miR-222在肝癌组织、癌旁组织以及正常组织中的表达依次增加。高表达miR-222肝癌组织中BBC-3蛋白的表达量明显下调，呈现显著负相关关系，从而间接证明了miR-222的靶基因为BBC-3。在本研究中，虽然癌旁组织中的miR-222的表达水平与正常组织相比明显增加，但与BBC-3蛋白的表达无统计相关关系，这一现象未见相关文献报道，值得进一步研究，有可能为阐明肝癌癌变机制和早期诊断肝癌提供新的方法。