霉酚酸酯对阿霉素肾病大鼠的保护作用及其机制研究*

王兴 ，白明辉 ，季佳 ，邹艳红 ，杨菲 ，邓李玲 ，范琳博，刘瑶，邱迪，刘秋红

（1.齐齐哈尔医学院附属第三医院 儿科，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2.齐齐哈尔医学院附属第三医院 口腔科，黑龙江 齐齐哈尔 161000；3.佳木斯大学附属第一医院 儿科，黑龙江 佳木斯 154002）

霉酚酸酯（mycophenolatemofeitil, MMF）是临床上治疗肾病综合征（nephrotic syndrome, NS）的常用药物[1-3]。大量研究证实，足细胞不可逆损伤是NS患者出现蛋白尿的主要机制之一，因此修复和保护足细胞是阻止肾功能恶化的主要策略[4]。microRNAs（miRNAs）在多种肾疾病发生、发展过程中扮演重要角色[5]。寻找MMF靶向调控的miRNAs分子对明确MMF的作用机制具有重要临床意义。笔者首先采用基因芯片技术，筛选与NS密切相关的miRNAs作为候选标志物，并通过探讨MMF对阿霉素肾病（adriamycin nephropathy, ADN）大鼠模型足细胞的保护作用，以及对肾组织miRNAs的影响，阐明MMF的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只6～8周龄成年健康SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠购自广州医药研究总院有限公司，动物许可证号：SYXK（粤）2013-0003。体重180～220 g，平均（192.46±6.13）g。将大鼠分笼饲养，3或4只/笼，喂以标准饲料及消毒的自来水，自由活动与进食、进水，保证动物房内安静、清洁、通风，温度控制在（22±1）℃。

1.2 受试药物与主要试剂

注射用盐酸多柔比星（阿霉素）（浙江海正药业股份有限公司），MMF（上海罗氏制药有限公司），PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供，miRelute miRNA 提取分离试剂盒、RT Reagent Kit、cDNA合成试剂盒、SYBR实时荧光定量聚合酶链反 应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司，组织蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、DAB显色试剂盒、TUNEL染色试剂盒购自北京天根科技生化有限公司，Trizol（美国Invitrogen公司），DEPC（美国Sigma公司），兔抗鼠Nephrin单克隆抗体、ZO-1兔抗鼠多克隆抗体、Podoplanin兔抗鼠多克隆抗体购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记二抗（北京中杉金桥生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器

Eppendorf 5427 R 台式高速冷冻离心机、各种型号的移液器购自德国Eppendorf公司，CFX-96-C1000 qRT-PCR 仪、miRNA PCR Array Data Analysis Software、iMake多功能酶标仪、SDS-PAGE电泳仪及电转膜仪购自美国Bio Rad公司，CX41倒置光学显微镜（日本Olympus公司），AUW120电子分析天平（日本岛津公司），Amersham电泳仪（瑞典Bioscience公司），LAS-4000 min凝胶成像数码分析系统（日本FUJIFILM公司）。

1.4 动物模型的复制与分组

经过为期1周的适应性饲养后，称量并记录大鼠体重，按照随机数字表法，将60只SD大鼠随机分为空白对照组（CTL组）、ADN模型组（ADN组）和MMF干预组（MMF组），每组20只。ADN组和MMF组大鼠都属于ADN模型，笔者按照参考文献[6]的方法，一次性尾静脉注射6.5 mg/kg阿霉素溶液（0.2%）复制ADN模型；而CTL组大鼠以同样的方式注射生理盐水作为对照。1周后收集大鼠24 h尿液，测定24 h 尿蛋白量，尿蛋白 ＞30 mg/24 h 则表示模型复制成功。最终，ADN组和MMF组分别有18和19只大鼠模型复制成功，用于后续实验。

1.5 药物干预

每日观察受试大鼠进食、排便、活动、精神状况等，称重1次/d。根据动物体重计算当日给药量。CTL组和ADN组：每天灌胃无菌生理盐水，1 ml/100 g，1 次 /d，连续给药 28 d。MMF 组：每天灌胃 1% MMF 溶液，20 mg/kg，1 次 /d，连续给药 28 d。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 肾功能 给药第 0、7、14、21 和 28 天时，用代谢笼采集大鼠24 h尿液，检测尿蛋白。实验结束时，经尾静脉采集外周血3 ml，置于枸橼酸钠真空采集管中，检测各组大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、血清肌酐（serum creatinine, Scr）水平。

1.6.2 肾组织病理学检查 待实验结束时，将大鼠颈椎脱臼处死，取出肾组织，用10%甲醛固定，包埋成蜡块。脱蜡水化后，用石蜡切片机切片，厚约2μm，置于载玻片上。烘干48 h后，进行HE、PAS或Masson染色，观察肾组织病理学变化。

1.6.3 大鼠肾脏细胞凋亡情况 按照 TUNEL 染色试剂盒说明书进行操作，置于光学倒置显微镜下观察肾组织细胞凋亡情况。

1.6.4 大鼠肾组织 miRNAs芯片分析 取大鼠肾组织提取总RNA：取100 mg组织样本置于EP管中，加入MZ裂解液，按照miRelute miRNA提取分离试剂盒说明书步骤进行操作；采用凝胶电泳检测RNA分子量，分光光度计检测RNA浓度。测定浓度和纯度后进行miRNAs芯片分析，后续操作委托上海康成生物工程有限公司完成。

1.6.5 肾组织 miRNAs ①提取肾组织总 RNA：实验方法同1.6.4。②RNA逆转录：根据逆转录试剂盒说明书操作进行。将cDNA保存至-20℃备用。③qRT-PCR：按照三步法进行PCR扩增。以组织cDNA为模板，以β-actin为内参，将20μl反应体系置于 37℃恒温水浴 60 min，85℃、5 s，加入去离子水至100μl，各反应孔取2μl进行PCR。冰浴中配制 20μl PCR 反应体系，反应条件：95℃预变性 30 s，95℃变性 5 s，60℃退火 30 s，共 45 个循环。根据NCBI数据库获得的资料设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。PCR结果判断：根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct值。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计学软件。计量资料以（±s）表示，多组比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验，方差不齐则采用Kruskal-Wallis非参数检验。采用Pearson相关性分析miRNAs与尿蛋白的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况及体重变化

实验过程中，CTL组大鼠饮食和活动正常；ADN组大鼠出现食欲减退、水肿、脱毛等情况，甚至有2只大鼠出现明显的腹水；与CTL组大鼠相比，MMF组大鼠虽然也存在食欲减退、生长迟缓的情况，但是较ADN组大鼠轻。比较3组大鼠给药后0、7、14、21和28 d的体重变化，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的大鼠体重比较，差异有统计学意义（F=243.451，P=0.000）；②3组大鼠体重比较，差异有统计学意义（F=28.752，P=0.000）；③ 3组大鼠体重变化趋势比较，差异有统计学意义（F=11.594，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，自给药7 d起，ADN组和MMF组大鼠体重低于CTL组大鼠（P＜0.05）；同时MMF组大鼠平均体重高于AND组（P＜0.05）。见表 1 和图 1。

2.2 各组大鼠尿蛋白的变化

3组大鼠尿蛋白含量比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点尿蛋白含量比较，差异有统计学意义（F=735.62，P=0.000）；② 3组大鼠尿蛋白含量比较，差异有统计学意义（F=28.769，P=0.000）；③3组大鼠的尿蛋白含量变化趋势比较，差异有统计学意义（F=54.678，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，给药当天，ADN组和MMF组大鼠尿蛋白含量高于CTL组（P＜0.05）；ADN组和MMF组大鼠尿蛋白含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；但是自给药7 d后，虽然MMF组大鼠尿蛋白含量仍然高于CTL组，但是低于ADN组（P＜0.05）。见表2和图2。

表1 各组大鼠不同时间点的体重比较 （g，±s）

表1 各组大鼠不同时间点的体重比较 （g，±s）

注：1）与CTL组比较，P＜0.05；2）与ADN 组比较，P＜0.05

组别 n 给药后0 d 给药后7 d 给药后14 d 给药后21 d 给药后28 d CTL 组 20 224.01±5.21 237.30±8.16 250.30±9.40 265.61±9.17 285.05±12.81 ADN组 18 210.39±6.23 219.00±10.461） 228.67±15.491） 234.06±23.291） 237.78±28.851）MMF 组 19 212.42±6.61 223.42±10.251）2） 234.37±12.251）2） 245.21±18.081）2） 263.32±22.341）2）

图1 各组大鼠体重变化趋势 （±s）

表2 各组大鼠不同时间点的尿蛋白比较 （mg/24 h，±s）

表2 各组大鼠不同时间点的尿蛋白比较 （mg/24 h，±s）

注：1）与CTL组比较，P＜0.05；2）与ADN 组比较，P＜0.05

组别 n 给药后0 d 给药后7 d 给药后14 d 给药后21 d 给药后28 d CTL 组 20 18.85±5.69 19.47±5.22 17.13±6.91 17.45±7.47 18.26±6.29 ADN 组 18 40.13±11.081） 95.87±23.711） 142.39±45.461） 229.35±76.151） 240.11±106.021）MMF 组 19 40.72±9.341） 51.56±16.421）2） 58.96±15.651）2） 61.71±16.231）2） 60.78±19.871）2）

图2 各组大鼠尿蛋白变化趋势 （±s）

2.3 各组大鼠生化指标比较

实验结束时，3组大鼠外周血BUN和Scr水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，ADN组、MMF组大鼠血清BUN和Scr含量高于CTL组（P＜0.05）；与ADN组比较，MMF组大鼠血清BUN和Scr含量降低（P＜0.05）。见表 3。

表3 各组大鼠生化指标比较 （±s）

表3 各组大鼠生化指标比较 （±s）

注：1）与CTL 组比较，P＜0.05；2）与ADN组比较，P＜0.05

组别 n BUN/（mmol/L） Scr/（μmol/L）CTL组 20 7.59±0.74 29.75±2.56 ADN组 18 18.12±0.831） 62.53±2.981）MMF 组 19 14.65±0.791）2） 38.27±2.611）2）F值 894.48 732.59 P值 0.000 0.000

2.4 各组大鼠肾组织病理学变化

光镜下观察CTL组大鼠肾小球形态基本正常，未见系膜增生，上皮细胞足突清晰可见；而ADN组大鼠肾小球肥大，系膜细胞增生，上皮细胞足突广泛融合，毛细管腔狭窄，间质出现轻、中度纤维化；MMF组大鼠肾小球变化较ADN组轻，但是与CTL组比较，仍可见明显差异。见图3。

2.5 各组大鼠肾组织细胞凋亡情况

TUNEL荧光染色定位于细胞核。CTL组、ADN组、MMF组大鼠肾组织细胞凋亡率分别为（3.56±1.32）%、（31.75±6.44）%和（14.73±5.18）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=172.608，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，ADN组大鼠肾组织细胞凋亡率高于CTL组（P＜0.05）；MMF组大鼠肾组织细胞凋亡率虽然高于CTL组（P＜0.05），但是低于ADN组（P＜0.05）。见图 4、5。

2.6 各组大鼠肾组织miRNAs芯片分析结果

采用GenePix Pro 6.0读取芯片扫描结果，提取探针信号值，将相同的探针值中值合并，对芯片结果进行中值标准化，筛选差异表达的miRNAs（Fold＞1.5且P＜0.05）。各组芯片之间信号强度相关性分析：CTL组与ADN组的相关系数为0.715，ADN组与MMF组的相关系数为0.632，CTL组与MMF组的相关系数为0.979。与CTL组相比，ADN组主要有19个miRNAs表达上调，23个miRNAs表达下调。与ADN组相比，MMF组主要有7个miRNAs表达上调，8个miRNAs表达下调。其中，相较于CTL组，ADN组大鼠肾组织中rno-miR-23a和rno-miR-300-3p表达上调，rnomiR-24、rno-miR-300-3c表达下调，而与ADN组相比，MMF组大鼠肾组织中rno-miR-24、rno-miR-300-3c表达上调，rno-miR-23a和rno-miR-300-3p表达下调。见图6。

图3 各组大鼠肾组织病理学变化

图4 各组大鼠肾组织细胞凋亡情况 （TUNEL×400）

图5 各组大鼠肾组织细胞凋亡率比较 （±s）

2.7 各组大鼠肾组织miRNAs含量比较

3组大鼠肾组织rno-miR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24、rno-miR-300-3c表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，与CTL组相比，ADN组大鼠肾组织rno-miR-23a和rno-miR-300-3p表达上调（P＜0.05）， 而 rno-miR-24 和 rno-miR-300-3c下调（P＜0.05）；与ADN组相比，MMF组大鼠肾组织rno-miR-24 和 rno-miR-300-3c表达上调（P＜0.05），rno-miR-23a和rno-miR-300-3p下调（P＜0.05）。见表4。

图6 层次聚类图

2.8 大鼠肾组织miRNAs与尿蛋白的相关性

经Pearson相关性分析，rno-miR-23a、rno-miR-300-3p与尿蛋白呈正相关（r=0.773和0.695，均P=0.000）；而rno-miR-24、rno-miR-300-3c与尿蛋白呈负相关（r=-0.664 和 -0.647，均P=0.000）。

表4 各组大鼠肾组织miRNAs表达水平比较 （±s）

表4 各组大鼠肾组织miRNAs表达水平比较 （±s）

注：1）与CTL组比较，P＜0.05；2）与ADN 组比较，P＜0.05

组别 n rno-miR-23a rno-miR-300-3p rno-miR-24 rno-miR-300-3c CTL 组 20 1.00±0.07 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.03 ADN组 18 2.89±0.121） 2.71±0.041） 0.61±0.021） 0.54±0.041）MMF 组 19 1.23±0.081）2） 1.47±0.041）2） 0.86±0.041）2） 0.95±0.051）2）F值 2350.62 10772.77 1832.87 714.06 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

随着人们饮食习惯的改变，加之环境因素的影响和生活工作压力的增大，我国慢性肾病患者人群呈逐年增加的趋势，成为威胁人类健康的主要原因之一[7]。目前普遍认为，足细胞损伤是糖尿病肾病患者主要的发病机制之一[8]。足细胞是位于肾小球基底膜外侧的最后一道滤过屏障，足细胞损伤导致肾小球基底膜通透性增加，肾小球滤过率降低，从而形成蛋白尿[9]。蛋白尿是绝大多数肾脏疾病早期出现的最常见的临床症状[10]。目前大多数关于NS发病机制的研究都是集中在足细胞特异性表达分子上，如Nephrin、ZO-1、Podoplanin等，尤其是Nephrin蛋白表达下调与足细胞损伤关系最为密切[11]，但是关于Nephrin蛋白的调控机制仍未明确。近几年，随着基因组学研究的深入及基因芯片技术的发展，越来越多的学者开始重视miRNAs在各种疾病发生、发展过程中发挥的重要作用。

miRNAs是广泛存在于真核生物细胞中仅具有22个核苷酸长度的内源性小分子物质，与人体内1/3基因的表达密切相关，因具有特异性、高度保守性、集簇性等特点，成为多种疾病研究的新靶点[12]。同样，也有大量miRNAs高表达于肾组织细胞，在肾脏发育和肾功能调控过程中发挥重要作用[13]。既往研究显示，miR-200家族、miR-300家族、miR-23家族、miR-26家族都与肾组织纤维化密切相关[14]。因此，探讨miRNAs与足细胞损伤的关系对于NS发病机制的研究及新药研发具有十分重要的临床价值。

目前，糖皮质激素一直是NS患者的首选药物，但是对于反复发作、激素依赖性/耐药性NS患者，临床建议选择免疫抑制剂治疗[15]。上个世纪末才开始将MMF用于激素抵抗性或复发性NS的治疗[16]。虽然降低蛋白尿的临床疗效已经得到普遍认可，但是其作用机制仍尚未明确。ADN大鼠是公认的、使用最为普遍的肾脏微小病变动物模型，关于模型复制方法，目前没有统一标准。有文献认为一次性注射大剂量阿霉素（≥7.5 mg/kg），虽然模型复制快，病变显著，但是易出现呕吐等副作用，大鼠死亡率较高[17]。而有文献建议多次注射小剂量阿霉素（≤5 mg/kg），虽然症状适中，模型复制成功率较高，但是症状出现缓慢，模型复制周期长[18]。因此，笔者基于多年实验经验，选择一次性尾静脉注射6.5 mg/kg，大鼠生理状况良好，死亡率低，症状适中。根据HE、PAS、Masson染色结果显示，模型大鼠具备典型的急性足细胞损伤的特征，不仅出现蛋白尿，而且可观察到肾小球肥大、系膜细胞增生、足细胞足突广泛融合、毛细管腔狭窄、间质出现轻、中度纤维化等足细胞损伤特征。同时笔者采用TUNEL染色法，证实模型大鼠足细胞凋亡率明显升高。但是经MMF作用28 d后，上述肾组织损伤、蛋白尿症状及足细胞凋亡情况都得到显著改善。为进一步证实MMF对足细胞保护的作用机制，笔者采用基因芯片技术筛查差异性表达的miRNAs，结果显示，与CTL组相比，ADN组有19个miRNAs表达上调，23个miRNAs表达下调。并且层次聚类图显示，miRNAs具有集簇分布的特点。另外，与ADN组相比，MMF组主要有7个miRNAs表达上调，有8个miRNAs表达下调。这其中都包括rnomiR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24和rno-miR-300-3c。rno-miR-23a和rno-miR-24位于19号染色体[19]，而miR-300-3p和miR-300-3c位于6号染色体[20]，因此笔者推测，19号和6号染色体的基因可能与NS发病密切相关，而且彼此在调控生物学行为过程中可能具有协同作用。为证实上述结论，本实验进一步采取qRP-PCR检测各组大鼠肾组织rno-miR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24和 rno-miR-300-3c的表达差异，结果与芯片结果基本一致。并且rnomiR-23a、rno-miR-300-3p、rno-miR-24和rno-miR-300-3c表达水平都与尿蛋白密切相关。以往，关于miR-23a/24/300-3p/300-3c的研究证实，这几种基因都属于靶向炎症因子的重要基因，除与炎症的发生、发展密切相关外，还参与细胞的分化、增殖等生物学行为。但是尚没有研究关注其与足细胞损伤的关系。笔者只是初步探讨miR-23a/24/300-3p/300-3c可能参与蛋白尿的生成和足细胞损伤过程，为MMF作用机制的研究提供新思路，并且为进一步药物研究提供潜在的靶点基因，但是还需要后续研究探讨具体对下游蛋白分子或信号通路的影响。

综上所述，通过复制ADN大鼠模型，笔者证实MMF具有抑制足细胞损伤和蛋白尿生成的作用，其机制可能是对19号和6号染色体部分miRNAs有干预作用。但是本项研究只是初步分析MMF对某些重要miRNAs的影响，为NS发病机制的研究及潜在治疗靶点的发现提供理论证据，仍然需要进一步研究证实miRNAs对其相应信号通路及蛋白的调控作用。