单纯疱疹病毒性脑炎模型中Toll样受体的表达及意义

罗涛，柴娟，经屏

单纯疱疹病毒脑炎（herpes simplex virus encephalitis，HSE）是 由单 纯 疱疹 病 毒（herpes simplex virus，HSV）引起的脑部炎症，是非流行性脑炎中最常见的类型。HSV是嗜神经的DNA病毒，分为1、2两个抗原亚型，近90%的HSE是由HSV-1引起。除病毒直接损伤神经元和胶质细胞外，病毒导致的免疫炎性反应也有关键作用。研究认为固有免疫与适应性免疫应答在机体抗病毒感染过程中发挥了重要作用[1]。

证据表明 Toll样受体（(Toll-like receptors，TLRs）介导的免疫反应在机体抗病毒感染过程中发挥重要作用[2]。HSV感染过程中大量促炎细胞因子的释放是导致HSE脑损伤的主要原因。TLRs可能参与或介导了小胶质细胞对HSV-1病毒的识别、对HSV-1感染的固有免疫反应和炎症反应过程。本研究将通过HSV-1感染小胶质细胞系BV2建立HSE的细胞模型，观察干预前后细胞TLRsmRNA的转录水平。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

BV2细胞购于北京协和医院；HSV-1病毒由武汉协和医院病毒室提供；高糖DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶（含EDTA）购自Hyclone公司，噻唑蓝、二甲基亚砜购自美国Sigma公司；Total RNA提取试剂（RNAiso Plus）、5×PrimeScript®RT Master Mix逆转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）购于日本TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 BV2细胞上HSV-1病毒滴度测定 BV2细胞以1×104的密度接种于96孔板，培养至单层生长，吸去培养液，接种连续10倍系列稀释的病毒维持液（5%胎牛血清DMEM培养基+稀释病毒），感染病毒孔加入含100µL病毒液的维持液，对照孔加入100µL维持液，每组5个复孔。细胞培养箱培养。每天观察并记录出现细胞病变的孔数。细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）划分标准：25%细胞病变（+）；25%～50%细胞病变（++）；50%～75%细胞病变（+++）；75%～100%细胞病变（++++）。当细胞病变不再发展时，采用Reed-Muench法计算50%组织细胞感染量（tissue culture infective dose 50，TCID50）。LgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数，距离比例=(高于50%病变率的百分数－50%)/(高于50%病变率的百分数－低于50%病变率的百分数)。

1.2.2 分组及处理 将BV2细胞以1×105的密度接种于6孔板内，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，细胞生长达60%时，随机分为对照组和HSV-1感染组。感染组予HSV-1病毒液（100TCID50），病毒作用6 h后更换培养基，各组继续培养24 h后观察细胞形态并收集细胞进行实验相关数据的测定。

1.2.3 各组TLR2、TLR3、TLR9转录水平检测

RNA制备试剂盒提取组织总RNA，采用TAKARA逆转录及实时荧光定量试剂盒检测各组TLR2、TLR3和TLR9 mRNA转录水平，以三磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）为内参对照。反应条件：95℃变性4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72℃延伸5 min。每样本设置3个复孔，StepOne Software 2.1软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的Ct（Threshold cycle）值，Ct值代表荧光实时定量PCR的结果，ΔCT=CT(目的基因)-CT(内参基因)，ΔΔCT=ΔCT(感染组)-ΔCT(对照组)。根据公式计算相对表达量=2-ΔΔCT。采用Primer 5.0软件设计引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（x±s）表示，组间比较采用独立样本均数t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSV-1病毒对BV2细胞滴度测定

HSV-1感染BV2细胞后，CPE表现为细胞折光性增强，突起增多，胞质内可见空泡，细胞间距增大。本研究将对数滴度的HSV-1感染BV2后，记录48 h内细胞形态学变化，TCID50=10-4.8/0.1mL，见表1。

表1 对数滴度的HSV-1感染BV2细胞48 h后CPE变化

2.2 HSV-1感染后BV2细胞TLR2、TLR3、TLR9转录水平变化

HSV-1感染组TLR2、TLR3、TLR9 mRNA转录水平均明显高于对照组（P＜0.01），见图2。

3 讨论

HSE是临床上多发的神经系统感染性疾病，HSV-1是引起非流行致命病毒脑炎的最常见原因[3]。目前认为HSE的发生可能与病毒复制的直接作用有关，还与病毒感染机体后诱导机体的免疫反应有关[4]。HSV-1侵入中枢神经系统后小胶质细胞立即被激活，激发机体固有免疫系统，诱导复杂的免疫应答过程，释放一系列炎症介质。TLRs是一类可激活人体固有免疫应答并在感染早期发挥保护性作用的重要膜受体家族[5]，小胶质细胞自身有多种TLRs位于细胞膜或胞浆内。病毒的核酸或包膜，作为一种病原体相关分子模式，可以被TLRs识别结合，启动机体的先天免疫反应和炎性反应[6]。迄今为止，已发现11种人类TLRs和13种小鼠TLRs。TLRs主要特征为胞外区有富含亮氨酸的重复序列（leucine rich repeat，LRR）以及胞内区有与白介素-I型受体同源的Toll/白介素-1受体（Toll/interleukin-1 receptor，TIR）结构域。LRR与识别病原体特异结构有关，TIR是TLRs下游信号转导的重要原件。一旦它们与HSV-1蛋白或病毒核酸这样的病原体结合，机体的先天免疫反应被激活，核因子Kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38蛋白激酶相继被激活，从而引起趋化因子、促炎细胞因子的产生[8]。

研究表明，有多种TLRs参与中枢神经系统感染引起的免疫反应。肺炎链球菌脑膜炎中发现TLR2、TLR4和TLR9 mRNA转录水平增加，大肠埃希菌脑膜炎中TLR2、TLR4和TLR7 mRNA转录水平增加[8]。人类TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9及鼠TLR3、TLR4、TLR7和TLR9能触发I型干扰素的合成和释放，在抗病毒免疫中起关键作用[9]。还有研究发现干扰素-α/β受体缺陷时，感染HSV-2的缺陷小鼠较野生鼠生殖道病毒复制和疾病进展显著加快，当给予TLR3、TLR7和TLR9的激活剂（合成的双链RNA，咪喹莫特和寡核苷酸）后，缺陷小鼠的病毒复制，疾病进展和死亡率无明显改善，而感染HSV-2的野生鼠却有明显改善，结果表明对抗HSV的干扰素的产生是由TLR3、TLR7和TLR9介导的[10]。

本研究发现在HSV-1感染小胶质细胞后，感染组TLR2、TLR3及TLR9 mRNA转录水平较对照组明显增加，说明TLR2、TLR3和TLR9可能参与了小胶质细胞对HSV-1病毒的识别。研究结果表明Toll样受体参与了HSE的发病，尤其是TLR2、TLR3和TLR9介导了机体对HSV-1感染的先天免疫反应和炎症反应过程。小胶质细胞受HSV-1病毒感染后，可能通过TLR2、TLR3和TLR9激活先天免疫反应，释放一些细胞因子参与病毒感染后的病理生理过程。但TLRs在病毒感染后所起的作用仍有争议，有报道TLR2激活后产生的过度炎性反应对HSE是有害的[4]，另有报道TLR2可协同TLR9对HSE产生保护作用[11,12]。因此，TLRs在HSE发病过程中作用和机制仍需进一步研究。