大鼠脊髓挫伤模型对比及行为学评价

唐 涛，马小翠，姚 冰，陈 一，朴浩哲*

(1.神经外科，2.麻醉科；中国医科大学肿瘤医院，辽宁省肿瘤医院，沈阳 110042)

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一种高致残率疾病，目前对其复杂的病理生理机制尚不完全清楚[1]。脊髓损伤动物模型作为脊髓损伤研究的重要载体，作用至关重要。Allen AR在1911年创造了重物坠击法制作脊髓损伤模型[2]。之后，随着对动物模型的要求逐渐提高，越来越多的造模方法被发明和改进，其中脊髓挫伤模型更适用于继发性脊髓损伤病理生理改的变研究。多中心动物脊髓损伤模型(Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study, MASCIS)及无限视野模型(infinite horizon, IH)应用广泛、效果显著，各有特点[3]。本实验通过建立不同参数的MASCIS模型及IH模型，对这两种模型进行比较分析，并通过行为学及组织学对其评价，分析模型特征，为脊髓损伤研究动物模型及参数选择提供必要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选用成年健康雌性SPF 级SD大鼠80只，体重250～300 g，由军事医学科学院动物实验中心提供，[SCXK(军)2012-0004]。随机分为4 组(n=20)，分别为(1)NYU 12.5 mm组，(2)NYU 25 mm组，(3)IH 150组，(4)IH 200组。饲养于隔离屏障环境 [SYXK(军)2012-0065]，每笼2只，12 h昼夜交替，室温22℃～23℃，相对湿度40%～45%，可自由获取食物及饮用水。实验于军事医学科学院基础医学研究所完成，饲养及实验严格遵守军事医学科学院啮齿类动物实验规范。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备

大鼠称重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(0.6 mL/100 g)麻醉，以T10 棘突为中心备皮，俯卧位固定于手术操作板上。咬骨钳咬除T9-11棘突及T10椎板，形成一个直径约4 mm类圆形骨窗。将大鼠移至脊椎固定器固定，调整棘突夹使T10脊髓平面置于水平位置。根据实验分组，NYU组应用MASCIS打击器，IH组应用IH打击器建立不同损伤程度的大鼠脊髓挫伤模型。NYU模型组设立打击终速度(±2 s)为质控范围，IH模型设立形变量(±2 s)为质控范围。打击后观察到T10脊髓段充血，大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩扑动，实际打击数据未超质控范围认定造模成功。术后大鼠灭菌饲养盒饲养，一周内给予软质食物及温水饲喂。每日3次膀胱按摩排尿护理至主动排尿恢复。

1.2.2 BBB运动评分(Basso, Beattie & Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale)

于术前2日建立BBB评分基线，术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周及8周进行双侧后肢BBB评分。评分由不清楚实验分组的工作人员实施[4]。

1.2.3 Grid Walking 评分(Grid Walking Test)

分别于术前2 d及术后4周和8周评价，将大鼠放置于架起的100×100 cm2格网上，单个网格大小为2×2 cm2，记录其自由行走总步数(Steps)和后肢从网上掉落次数(Drops)，计算Drops/Steps比值。

1.2.4 热痛

测试前将大鼠置于测试平台上的有机玻璃箱内，设置测试环境温度为27℃，适应15 min后开始测试。应用热辐射仪(SERIES 8 Model 390G IITC LifeScience，USA)对大鼠后肢足底中心进行照射，通过反光镜进行监测，记录从开始照射到大鼠抬脚的反应时间。5 min后重复检测，总共重复测量6次，去掉最高值和最低值，计算其余4次的平均值和标准差，确定(±2 s)为正常范围，如有测量值超出该范围应当去除。如无异常值，该平均值作为该动物正常热痛阈值。

1.2.5 组织学观察

于手术后8周将大鼠麻醉后多聚甲醛PBS缓冲溶液灌注，取T3至L4阶段脊髓放置于多聚甲醛PBS缓冲液4℃过夜，经30%蔗糖溶液脱水后，OCT包埋。恒冷切片机连续切片，片厚20 μm，冷贴片，选取损伤中心切片行HE染色，应用ImageJ进行灰度转换，计算残余脊髓组织面积、残余组织面积占总横断面积的百分比[5]。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 造模成功率比较

共造模动物80只，脊髓打击阶段NYU组成功36例，成功率90%，IH组成功39例，成功率97.5%(表1)，行卡方检验，P>0.05，两组造模方法造模成功率无统计学差异。

表1 脊髓损伤造模结果Table 1 Results of modeling of spinal cord injury

2.2 BBB评分结果

术前所有实验动物均于适应新的饲养环境后2天进行baseline检测，未发现异常动物，得分均为21分。脊髓打击造模后3天行BBB评分，所有动物均出现不同程度双侧后肢瘫痪，虽偶见体动，但大部分评分还是接近于0分。术后1～2周，实验动物评分明显上升，IH 150组、IH 200组以及NYU 12.5 mm组上升趋势相似，明显好于NYU 25 mm组(P<0.05)。4周后BBB评分上升进入平台期，上升趋势减缓，IH 150组与NYU 12.5 mm组表现出较IH 200组明显的恢复趋势(P<0.01)。IH 150组与NYU 12.5 mm组间无统计学差异，IH 200组低于IH 150组与NYU 12.5 mm组(P<0.001)，而高于NYU 25 mm组(P<0.001)。(图1)

2.3 Grid Walking结果

损伤后第4周及第8周进行Grid Walking 评价(图2)，可见损伤后后足坠落率明显升高(P<0.001)；第4周和第8周NYU 25 mm组均显示出更高的失误率(P<0.01)。

2.4 Hargreaves 结果

脊髓损伤后模型动物足中心热痛明显，且有随损伤加重热痛显著的趋势(P<0.05)，NYU 25 mm组结果显示好于其它造模组，考虑因为该组动物后肢运动功能尚未恢复至可自由运动的阶段，掩盖了实际结果。由于该评价结果标准差较大，同时间点各组间比较无统计学差异(图3)。

2.5 组织学结果

定量分析脊髓损伤中心层面残余组织面积及残余组织面积/脊髓总横断面积比值(图4，图5)，损伤中心脊髓总横断面积随损伤程度的增加而降低，NYU 25 mm组残余组织面积最少，明显低于其他研究组(P<0.001)；IH 150组与NYU 12.5 mm组损伤中心层面残余组织无统计学差异；在损伤中心处残余组织面积占总横断面积的百分比与损伤程度的增加成反比(P<0.001)。

注： 损伤组与正常组相比坠落率明显增高， P <0.001。第4周和第8周NYU 25 mm组与同时段其它损伤组相比，均显示出更高的坠落率，P <0.01。图2 各组Grid Walking行为学评价Note. The drop rate of the injury group was significantly higher than that of the normal group, P < 0.001. At the 4th and 8th weeks, the NYU 25 mm group showed a higher drop rate than the other injury groups at the same time, P < 0.01.Figure 2 Behavioral evaluation of grid walking in each group

3 讨论

注：A.NYU 25 mm组损伤中心层面残余组织面积明显低于其它损伤组，P < 0.001；B. 损伤中心层面残余组织面积与总横截面积的比值与损伤程度的增加成反比，P < 0.001。图4 定量分析脊髓损伤后损伤中心层面残余组织Note. A. The residual tissue area at the injury epicenter of the NYU 25 mm group was significantly lower than that of the other study groups (P < 0.001). B. The ratio of the residual tissue area at the center to the total cross-sectional area was inversely proportional to the increase in the degree of injury (P < 0.001).Figure 4 Quantitative analysis of the residual tissue at the injury epicenter after spinal cord injury

脊髓挫伤模型是一种急性脊髓损伤模型，因其致伤过程与人类脊髓损伤过程高度相似，被广泛应用于创伤性脊髓损伤病理生理机制研究中[6-7]。研究人员通过使用MASCIS及IH两种不同的造模方法，建立4种不同损伤程度的大鼠脊髓损伤模型，造模成功率高，均达到实验设计要求。MASCIS打击模型失败原因主要为打击速度未达到设计要求以及打击偏离；IH打击模型失败原因为组织位移较小。BBB评分显示，IH 150组、IH 200组以及NYU 12.5 mm组动物均于损伤后4周恢复到12分以上，而NYU 25 mm组只达到(8.30±1.56)分，4周后运动功能恢复进入平台期，提示IH 150 kdyn、IH 200 kdyn和NYU 12.5 mm损伤程度模型更易于后期观察运动恢复情况，且由于Grid Walking和Hargreaves等行为学评价在实验动物BBB评分高于12分后结果更确切[8]，IH 150组、IH 200组以及NYU 12.5 mm组动物在Grid Walking和Hargreaves评价中均表现出与其损伤程度相关的结果。通过对损伤后8周损伤中心脊髓组织残余组织量及残余组织面积占总横断面积的百分比的研究，证明损伤程度与中心脊髓组织残余组织量及残余组织面积占总横断面积的百分比相关。

注：各损伤组损伤后与损伤前比较足中心热痛明显，P <0.05；同一时间点个损伤组间比较无统计学差异，P >0.05。图3 各组Hargreaves行为学评分Note. After spinal cord injury, the foot center heat pain of the model rats was obvious, P <0.05; there was no statistical difference between the injury groups at the same time point, P >0.05.Figure 3 Hargreaves test behavior scores in each group

MASCIS打击器与IH打击器是目前应用最广泛、最成熟的商品化脊髓挫伤打击器[3]，两者均能方便的调整参数，从而控制损伤严重程度[9]，达到实验设计要求，但在实际工作中研究人员发现两者各有优缺点。

注：A. IH 150组；B.NYU 12.5 mm组；C.IH 200组；D.NYU 25 mm组。图5 损伤中心HE染色Note. A. IH 150 group；B.NYU 12.5 mm group；C.IH 200 group；D.NYU 25 mm group.Figure 5 Histological changes revealed at the spinal cord cross-sections taken at the epicenter of injury(HE staining)

MASCIS打击器可以提供范围更广的损伤范围，并能通过读取的实际参数计算损伤力的大小；但实际操作中对于操作人员的要求较高，需要人工提起打击杆，很难控制其对脊髓的压迫时间[10]；打击杆下落时易与套筒摩擦，导致实际速度未达到设计速度，损伤程度差异过大；打击头精度不高，容易偏离中心，导致双侧损伤不均一，甚至打击到骨质，造成造模失败。

IH打击器能够很好的控制打击力度，打击部位精确，并能直接通过软件观察到组织位移程度及实际受力情况，易于进行质量控制，双侧损伤均一性高[11- 12]；但IH打击器应用电机控制，达到设置打击力后瞬时收回，不能设置持续挤压时间，不能完全模拟临床脊髓损伤的病理生理改变；参数设置范围较小，大鼠造模推荐参数范围为100～200 kdyn，损伤程度差别较小，不易建立梯度损伤模型。

MASCIS和IH模型均能满足脊髓损伤病理生理机制研究要求，为创伤性脊髓损伤提供有效的研究手段，因其本身特点存在部分差异，在应用过程中应根据实验目的选取适当的造模方式及造模参数，以利于揭示疾病本质。