甲硝唑阴道凝胶安全性试验研究

龚 云，张英帅*，凌勇根，刘逆夫，蒋飞荣，赵 丞

(1. 株洲千金药业股份有限公司，湖南 株洲 412007；2. 湖南省药物安全评价研究中心，长沙 410331)

甲硝唑是细菌性阴道病的常用药物，临床接受程度很高；《2010年美国疾病控制中心阴道炎治疗指南》和中华医学会拟定的《细菌性阴道病诊治指南(草案)》首选方案均为甲硝唑；但口服或注射制剂副作用大[1-2]，容易产生胃肠道反应、过敏性休克和神经系统疾病[3]，患者耐受性差[4]。但甲硝唑制成外用的阴道凝胶制剂则可极大的降低副作用，明显提高患者耐受性[5-7]。本项研究旨在考察甲硝唑阴道凝胶的外用安全性，通过甲硝唑阴道凝胶对实验兔阴道给药刺激性试验和对豚鼠皮肤的过敏性试验[8-10]，为临床用药提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级白色豚鼠，18只，体重320～340 g，雌雄各半。[SCXK(湘)2015-0004], [SYXK(湘)2010-0008],合格证编号：No.43608300000083。雌雄分笼,饲养于普通环境内，室温：19.4℃～26.0℃，湿度：49.5%～70.6%。

普通级实验兔，12只，体重220～250 g，雌性。[SCXK(湘)2015-0004], [SYXK(湘)2015-0016],合格证编号：No.43608300000101。饲养于普通环境内，室温：21.9℃～26.1℃，湿度：52.6%～67.7%。

实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会(IACUC)批准，批准号为IACUC-2015(1)062。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

苦味酸(分析纯，台山市化工厂有限公司，批号：201201)；无水乙醇(分析醇，天津市致远化学试剂有限公司，批号：20120621)。2，4-二硝基氯苯(分析纯，天津市光复精细化工研究所，批号：20121201)，致敏浓度1%，激发浓度0.1%。甲硝唑阴道凝胶(规格：0.75%，每支5 g；)，成品批号：20150407；甲硝唑阴道凝胶空白样品，批号：20150630；由株洲千金药业股份有限公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 皮肤刺激性实验

(一)实验分组

选取检疫合格实验兔18只，每组6只动物，雌雄各半。根据性别体重采用区段随机方法分为3组，分组后进行二次编号，编号规则为“组别编号+性别+个体编号”。如1F01，为第一组雌性动物的第1号。各组分别为①基质组(甲硝唑阴道凝胶空白样品)，动物正式编号为1F01～1F03、1M04～1M06，笼卡标识为白色；②阳性对照组(2,4-二硝基氯苯)，动物正式编号为2F01～2F03、2M04～2M06，笼卡标识为蓝色；③甲硝唑阴道凝胶组，动物正式编号为3F01～3F03、3M04～3M06，笼卡标识为红色。采用5%苦味酸溶液标识动物。将豚鼠背部两侧用剃毛法进行脱毛处理。脱毛区不少于3×3 cm2。

(二)给药方法

①致敏接触 在第0、第7天和第14天，将甲硝唑阴道凝胶空白样品、1% 2，4-二硝基氯苯和甲硝唑阴道凝胶分别涂在相应的动物左侧背部脱毛区，二层纱布(约2.5×2.5 cm2)和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。每只动物分笼饲养，6 h后用温水去掉药物。

② 激发接触 末次给受试物致敏后14 d，在激发接触阶段，将甲硝唑阴道凝胶空白样品、0.1% 2，4-二硝基氯苯和甲硝唑阴道凝胶涂于相应的动物右侧脱毛区，二层纱布(约2.5×2.5 cm2)和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。6 h后用温水去掉药物，即可比较观察皮肤过敏反应情况，然后于24、48、72 h再次观察。

(三)观察指标及评价方法

试验期间，每日观察每只动物的症状。按表1记录各组各时间的平均分值，同时应密切观察动物是否有哮喘、站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应出现。根据试验组和对照组动物皮肤反应的差别，判断受试物对皮肤过敏反应的性质，并根据表2计算致敏发生率：

致敏发生率(%)=

表1 皮肤过敏反应程度的评分标准Table 1 Scoring standard for the degree of skin allergic reaction

表2 皮肤致敏性评价标准Table 2 Skin sensitization evaluation criteria

(四)统计学方法

1.3.2 兔阴道给药刺激性实验

(一)实验分组

选取检疫合格12只雌性实验兔，根据体重采用完全随机方法分为两组，每组6只。分组后进行二次编号，编号规则为“组别编号+性别+个体编号”。如1F01，为第一组雌性动物的第1号。各组分别为①基质组(甲硝唑阴道凝胶空白样品)，动物正式编号为1F01～1F06，笼卡标识为白色；②供试品组(甲硝唑阴道凝胶)，动物正式编号为2F01～2F06，笼卡标识为红色。

(二)给药方法

本试验给药方式为实验兔阴道给药。每只实验兔于固定器上束缚固定其后肢，提起动物尾巴暴露出阴道口，给药量为每只0.5 g凝胶，连续给药7 d。①基质组放入甲硝唑阴道凝胶空白样品作为对照；②供试品组放入0.5 g甲硝唑阴道凝胶(供试品)；初次接触后24 h和每次试验操作前记录阴道口和会阴溢液、红斑和水肿状况。末次给予24 h后取6只实验兔(动物编号为：1F01～1F03和2F01～2F03)实施CO2麻醉安乐死，将供试品和基质组的进行比较然后完整切开阴道后纵向剖开，检查上皮组织层的刺激、损伤以及坏死情况，将取下的阴道组织放入固定剂中固定后进行组织学检查评价。另6只实验兔(动物编号为：1F04～1F06和2F04～2F06)继续观察7 d(若存在持久性损伤，延迟观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间)，同法肉眼观察记录阴道口和会阴溢液、红斑和水肿状况并进行组织病理学检查，以了解刺激性反应的可逆程度。

(三)观察指标及评价方法

肉眼观察评价：肉眼观察实验兔的阴道组织与对照兔阴道组织进行比较后记录。

组织学评价：按表3和表4规定的分类系统对阴道组织进行评分。给药组动物显微镜评价记分相加后再除以观察总数即得出给药组的平均记分，最大记分为16。对照组同法计算。对照组动物中出现显微镜评价总分大于9时，表明试验操作中可能造成损伤。给药组平均记分减去对照组平均记分即得出刺激指数。

2 结果

2.1 皮肤刺激性试验结果

通过豚鼠皮肤刺激性试验，各组动物均未出现死亡、休克等严重全身性过敏反应。具体结果见表5和表6。结果表明：在本试验条件下，甲硝唑阴道凝胶对豚鼠未见明显主动皮肤过敏反。

2.2 阴道刺激性试验结果

通过实验兔阴道刺激性试验结果可见：末次给药24 h后解剖的实验兔供试品组刺激指数为0，无刺激反应；继续观察7 d后解剖的实验兔供试品组刺激指数为0，无刺激反应；在本试验条件下，甲硝唑阴道凝胶，每天1次，共给药7次，对实验兔的阴道组织无明显刺激反应。具体观察记录见表7。

3 讨论

本试验旨在探讨甲硝唑阴道凝胶外用给药的安全性，为该药的临床应用及市场推广提供试验依据。

本试验按照国家食品药品监督管理局颁布的《药物非临床研究质量管理规范》(2003)和《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(2014)的规定进行。通过甲硝唑阴道凝胶对实验兔阴道给药刺激性试验。显微镜下观察结果显示：基质组、供试品组末次给药24 h后显微镜下观察解剖的实验兔均阴道黏膜上皮细胞排列整齐，完好无损，未见变性、坏死，固有层结缔组织内未见血管充血，水肿，炎症细胞浸润等病理变化。继续观察7 d后显微镜下观察仅基质组1F04号实验兔靠近宫颈处阴道黏膜下层炎症细胞浸润，其他实验兔阴道黏膜上皮细胞排列整齐，完好无损，未见变性、坏死，固有层结缔组织内未见血管充血，水肿，炎症细胞浸润等病理变化。结果表明甲硝唑阴道凝胶外用给药未引起阴道刺激性反应。通过采用甲硝唑阴道凝胶对豚鼠皮肤的过敏性试验，结果表明在本试验条件下，甲硝唑阴道凝胶对豚鼠未见明显主动皮肤过敏反应。试验结果表明甲硝唑阴道凝胶用于治疗细菌性阴道炎是较安全的。

表3 阴道组织反应显微镜分类系统Table 3 Microscopic classification system for the vaginal tissue reaction

表4 刺激指数Table 4 Indexes of irritation

注：组织的其他异常情况也应予以记录并包括在反应的评价中。

Note. Other abnormalities of the tissues should also be recorded and included in the evaluation of the response.

凝胶剂是近年来研究的较多的新剂型[11-15]，具有涂展性好、透皮吸收性好、避免肝脏首过效应、减少胃肠道酶解破坏、局部起效直达病灶疗效好等优点，避免了口服和注射剂产生的多种副作用，用药安全性获得极大的提高。

甲硝唑用于治疗细菌性阴道炎疗效显著[16-17]，但常规给药容易产生的副作用，副作用以胃肠道反应、过敏反应和神经系反应为主[1-3]。其中胃肠道反应和神经系统反应主要由甲硝唑药物本身引起，且胃肠道反应与药物剂量相关，剂量增加反应越明显[18-19]。而过敏反应多发生在使用甲硝唑注射剂的患者，有可能是甲硝唑药物本身引发，也可能是杂质或辅料等其他成分引起，引发机理尚不明确[20]。甲硝唑副作用一直困扰医生和患者。而将甲硝唑制备成凝胶剂以后很好的解决了此项难题。甲硝唑阴道凝胶可使药物主要在用药的局部作用。药物动力学研究显示采用阴道凝胶制剂的患者甲硝唑血清浓度仅为口服制剂的2%[7]。笔者通过小猪的离体皮肤透过性试验，结果显示：12 h透过量约为给药量的27%，皮内残留约为给药量的1.3%，具体试验内容将在后续研究中报道。以上研究表明：采用甲硝唑阴道凝胶的患者血药浓度远小于采用甲硝唑口服制剂的患者，因而极大的降低了副作用小，提高了患者用药的耐受性和安全性。

表5 甲硝唑阴道凝胶给予豚鼠主动皮肤过敏试验观察症状评分情况表(6 h，24 h，n=6)Table 5 Score table of skin allergy test results for guinea pig skin administered metronidazole vaginal gel(6 h,24 h)

表6 甲硝唑阴道凝胶给予豚鼠主动皮肤过敏试验观察症状评分情况表(48 h，72 h，n=6)Table 6 Score table of skin allergy test results for guinea pig skin administered metronidazole vaginal gel(48 h,72 h)

表7 实验兔解剖现场凃敷局部肉眼观察及病理组织学检查记录表Table 7 Checklist of histopathology and visual observation for field coating of experimental rabbit anatomy