陈皮的凝血止血与抗血栓作用研究

韦金红，韦金双，李 琴，邓连龙，吴炜邦，赖廷利，黄锁义,4*，梁凌玲

(1. 右江民族医学院 临床医学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院 药学院，广西 百色 533000；3. 右江民族医学院 医学检验学院，广西 百色 533000；4. 右江民族医学院 科学实验中心、广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室，广西 百色 533000)

陈皮(Pericarpiumcitrireticulatae)又名橘皮，为芸香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮，是我们国家传统的药食两用材料，具有燥湿化痰、理气健脾的作用[1]。林园园[2]等人研究发现陈皮配伍汤药对高脂饮食诱导的肥胖大鼠具有显著的减肥降脂作用。陈皮中的果胶能降低脂类物质在器官内的沉积，对高脂饮食引起的动脉粥样硬化具有较好的疗效[3]。陈皮中含有的挥发油甲基橙皮甙能扩张血管，增加冠状动脉血流量，使血压下降，心率减慢；同时也能降低胆固醇含量，抑制试验性溃疡，降低毛细血管的通透性，使纤维蛋白的溶解增强，抑制血栓的形成，具有调节肠道的功能和利胆作用[3]。有研究表明陈皮具有抗衰老及抗氧化、抗肿瘤的作用[4]。也有研究表明其可改善心脑血管疾病，从而达到预防和治疗心脑血管疾病的功效[5]。

随着社会不断发展、人民生活水平不断提高，陈皮用量正在逐年增加，据统计我国陈皮总年销量大约在5～6万吨[6]。我国柑橘的种植产量决定了陈皮产量；柑橘制成陈皮方法简单，即将剥下的柑橘皮晒干或者是阴凉处干燥、烘干即可[6]。陈皮加工后可用于中成药、食品原料或添加剂、中药饮片陈皮茶等[6]。

陈皮的应用十分广泛，发展前景非常可观。陈皮的化学成分与药理作用很广，现有研究已涉及各领域，但关于陈皮的凝血止血与体外血浆复钙的研究极少有报道。本研究旨在考查陈皮对小鼠止血时间和凝血时间及大鼠血浆复钙时间的影响，以便更深入地研究其止血及体外凝血活性，从而推测其抗血栓作用，为更好地开发和利用陈皮资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物

(1)昆明种SPF小白鼠，清洁级，40只雌雄各半，体重18 ～ 25 g；(2)SD大鼠，35只，体重250 ～ 300 g，均由右江民族医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(桂)2012-0003。在室温25℃左右环境中饲养，自由进食和饮水，每隔一日清扫一次以保持饲养笼内干净。

1.1.2 药品

陈皮(广西贵港市绿之源种养发展有限责任公司中药饮品厂，批号：160901)；阿司匹林肠溶片(舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：160502)；云南白药粉(云南白药集团股份有限公司，批号：ZJA1619)；无水氯化钙(广州新建精细化工厂，批号：20051213)。

1.1.3 仪器

HH-S4数显恒温水浴锅(上海上登实验设备有限公司)；RE-3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；BS-1100电子称(上海友声衡器有限公司)；JSB15-05电子计重器(上海浦春计量仪器有限公司)；TOL80-2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；一次性玻璃点样毛细管(规格：0.3 mm×100 mm)；12号灌胃针数支；一次性真空采血管(江苏康捷医疗器械有限公司，批号：20171107)；小鼠固定器。

1.2 试验方法

1.2.1 药材鉴定

药材陈皮由右江民族医学院药学院黄锁义教授鉴定为芸香科植物橘(C.Blanco)的干燥成熟果皮。

1.2.2 陈皮的提取

采用吴晓东等[7]的方法改进，称取陈皮100 g，用5倍蒸馏水室温浸泡2 h，在温度为70 ～ 80℃下水浴浸提1 h，自然冷却至室温后，用纱布过滤；滤液置于RE-3000旋转蒸发器浓缩，将浓缩液定容至100 mL，配成100%(1 ml含生药1 g)的陈皮原药液，置于4℃冰箱保存备用，试验前再配置成所需浓度使用。

1.2.3 分组和给药

取40只昆明种SPF级小鼠，雌雄各半，适应性喂养1周后称重。为保证灌胃量的准确性，试验期间每隔3天称重一次。各组按体重将雌雄比例1:1随机分为5组，即正常对照组，低、中、高陈皮剂量组和云南白药组，每组8只。以低、中、高陈皮剂量(2.0、3.0、4.0 g/kg)和云南白药(0.5 g/kg)每日灌胃给药一次，正常对照组给予等体积0.9%生理盐水，连续灌胃14 d。云南白药组给药剂量参考文献[8]。陈皮各剂量组参考成人临床用药剂量(10 g)[9]，通过成人与小鼠等效剂量折算系数(0.0026)换算取近似最低剂量[10]，并按常用倍数(1.5、2倍)设置。给药体积：0.2 mL/10 g。每次动物试验均遵循动物实验伦理要求。

1.2.4 小鼠的凝血时间(CT)测定

末次灌胃给药后1 h，参照张海英等[11]的方法，将小鼠侧压于桌面。用一次性定玻璃点样毛细管于小鼠眼内眦取血，至血流充满玻璃点样毛细管内，放平，开始计时。每隔30 s交替从两端折断玻璃点样毛细管一小段，检查有无血凝丝出现。一旦出现血凝丝，从另一端折断进行验证，计算平均两端出现血凝丝的时间，即为CT。

1.2.5 小鼠止血时间(BT)的测定

动物分组和给药均同2.2，末次(第14天)灌胃给药后1 h，参照封烨等[12]的方法，用小鼠夹固定小鼠，以手术剪将距离小鼠尾尖0.5 cm处剪断，待血液自行溢出时开始计时，每隔30 s用滤纸吸去血滴一次，直至滤纸吸时无血表示出血自然停止，即为BT。

1.2.6 大鼠体外血浆复钙时间(PRT)的测定

参照石磊等[13]的方法，SD大鼠心脏取血，用3.2%枸橼酸钠以1：9的比例抗凝，混匀后用TOL80-2B台式离心机以1500 r/min，离心10 min，取出采血管分离血浆(上层)。试验在37℃的环境中进行，用1.5 mL离心管，在管中加入血浆0.1 mL，再分别加入生理盐水、阿司匹林水溶液(0.3 g/kg)、陈皮提取物水溶液低剂量(1.0 g/kg)、中剂量(2.0 g/kg)、高剂量(4.0 g/kg)各温育1 min后分别加入0.025 mol/L CaCl2溶液0.1 mL，混匀后开始记时。阿司匹林组给药剂量参考文献[14 ]。陈皮各剂量组参考成人临床用药剂量(10 g)[9]，通过成人与大鼠等效剂量折算系数(0.018)换算取近似中剂量[10]，并按常用倍数(1/2、2倍)设置。每隔 15 s用牙签挑1次观察纤维蛋白丝是否形成，直至纤维蛋白丝形成 ，所需时间即为PRT。

1.2.7 数据处理

1.3 结果

1.3.1 陈皮对小鼠凝血时间(CT)的影响

小鼠灌胃给药陈皮水提物14 d后，陈皮水提物低、中、高剂量组的平均凝血时间明显延长，但与正常对照组相比差异无统计学意义，与云南白药组相比差异无统计学意义，结果见表1。

表1 陈皮水提物对小鼠凝血时间的影响

1.3.2 陈皮对小鼠止血时间(BT)的影响

小鼠给药陈皮水提物后，不同浓度陈皮水提物对小鼠出血时间均有缩短，其中陈皮水提物低剂量组的出血时间明显缩短，与正常对照组相比差异有统计学意义(P< 0.05)，与云南白药组相比差异无统计学意义；陈皮水提物中、高剂量组止血时间有缩短趋势，但与正常对照组相比无统计学意义。表明在此试验范围内，陈皮水提物剂量为2 g/kg具有较好的止血效果，结果见表2。

表2 陈皮水提物对小鼠止血时间的影响

注：与正常对照组比较 *P< 0.05

Note:Compared with the normal control group *P< 0.05

1.3.3 陈皮对大鼠体外血浆复钙时间(PRT)的影响

陈皮水提物低、中、高剂量组的复钙时间明显延长，中、高剂量组的复钙时间与正常对照组相比有统计学意义(P<0.05)，与阿司匹林对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；低浓度组的复钙时间与正常对照组和阿司匹林对照组相比均无统计学意义(P>0.05)。表明陈皮水提物剂量为2、4 g/kg具有较好的延长复钙时间，起到体外抗凝活性，能抑制血栓形成(表3)。

表3 陈皮水提物对大鼠体外血浆复钙时间的影响

注：与正常对照组比较 *P< 0.05

Note:Compared with the normal control group *P< 0.05

2 讨论

近年来，血栓性疾病已经成为严重危害人类健康、影响人们生活质量的重大疾病[15]。现代医学认为，血栓的产生病因遵守Virchow三大定律：一是血流瘀滞因素，二是血液高凝状态，三是血管内皮损伤[16]。

通常我们将刺破的皮肤自然出血到出血自然停止所需时间为出血时间，反映止血功能有无异常。凝血时间是指血液离开血管，在体外发生凝固的时间。它与出血时间不同，主要反映是否有抗凝物质增多。血液凝固过程是血浆凝血因子受到内源性或外源性激活引起的一系列化学连锁反应，血浆复钙时间反映的是内源性凝血系统功能。通过出血时间、凝血时间以及血浆复钙时间的变化，可从止血功能以及凝血系统两个方面，全面反映药物止血作用与抗凝作用，是研究药物止血作用的经典实验[17]。

陈皮是一种传统中药，在民间运用十分广泛，《新修本草》、《汇言本草》和《本草经百种录》等历代本草多有记载[18]。陈皮的成分多种多样，其主要活性成分为黄酮类、挥发油、生物碱、陈皮多糖和微量元素等[19]。黄酮类化合物是陈皮的主要有效成分之一，目前发现的黄酮类化合物有60多种，其中二氢黄酮苷类成分主要包括橙皮苷等，多甲氧基黄酮类成分主要包括川陈皮素[20]。挥发油中的有效成分主要由2-甲氨基苯甲酸甲酯、β-月桂烯、γ-松油烯、d-柠檬烯、异松油烯等组成[20]。生物碱的主要成分是辛弗林和N-甲基酪胺。陈皮多糖主要由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖等组成[20]。陈皮中也含有包括锰、铁、钛、铬、钾、钠、钙、镁、铜、锌等多种微量元素[20]。陈皮常煎汤内服，因此本研究采用陈皮水提物对陈皮的凝血止血与体外血浆复钙作用进行了科学评价。

由试验结果可知：(1)小鼠止血试验中，小鼠给药陈皮水提物后，不同浓度陈皮水提物对小鼠出血时间均有缩短，其中陈皮水提物低剂量组(2 g/kg)的出血时间明显缩短，与正常对照组相比差异有统计学意义(P< 0.05)，与云南白药组相比差异无统计学意义(P> 0.05)；陈皮水提物中、高剂量组(2、4 g/kg)止血时间有缩短趋势，但与正常对照组相比无统计学意义(P> 0.05)。表明陈皮水提物剂量为2 g/kg具有较好的止血效果。(2)大鼠体外血浆复钙实验中，陈皮水提物低、中、高剂量组的复钙时间明显延长，中、高剂量组(2、4 g/kg)的复钙时间与正常对照组相比有统计学意义(P< 0.05)，与阿司匹林对照组相比差异无统计学意义(P> 0.05)；低浓度组的复钙时间与正常对照组和阿司匹林对照组相比均无统计学意义(P> 0.05)。表明陈皮水提物剂量为2、4 g/kg具有较好的延长复钙时间，起到体外抗凝活性，能抑制血栓形成。

陈皮2 g/kg剂量具有止血作用；陈皮2、4 g/kg剂量有延长体外血浆复钙时间作用，具有一定的体外抗凝活性，抑制血栓形成；其量效关系并非随浓度增高而增强。陈皮具有止血作用，也验证了张艳艳[1]等人的研究，其作用成分可能是多甲氧基黄酮类成分中的川陈皮素。但由于试验条件有限，对相应的止血、抗血栓机理缺乏深入研究，因此有必要在进一步的试验中建立病理动物模型，以更确切地研究陈皮的药理作用。