环介导等温扩增技术在细菌性肠道传染病诊断中的应用研究进展

张维强，张杨

天津市第一中心医院 (天津 300192)

肠道传染病的发生多与细菌、病毒、寄生虫等有关，主要以消化道症状为主，具有起病急、传染性强、传播快、危害大等特点，通常在人群密集的食堂、饭店等场所暴发及流行[1]。细菌性肠道传染病主要包括霍乱、细菌性痢疾、伤寒及其他感染性腹泻疾病等，若不及时采取治疗措施，将引起严重并发症，甚至造成患者死亡[2]。因此，寻求操作简单、成本低、高效的肠道传染病检测技术在病情控制中十分关键。现就环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的原理、特点及相关肠道传染病的研究进展展开以下综述。

1 LAMP技术原理及特点

LAMP最早是由日本学者发明，被称为新型体外扩增核酸片段分子生物学技术，即LAMP技术。LAMP技术的作用原理是将靶基因的6个区域设计为4种特异引物，并根据链置换反应，于60～65 ℃下孵育1 h，并对扩增产物进行判定，明确是否有目标基因的存在，扩增DNA时需依靠DNA聚合酶，而扩增RNA时仅需加入反转录酶；2002年有学者在LAMP反应体系中又加入2条环引物，进而加快了反应速度，且使检测效果得到提升[3]。LAMP技术无须特殊、精密的仪器及严格的实验室环境，具有操作简单、成本低、高灵敏度、高特异度等特点。

2 LAMP技术在细菌性肠道传染病诊断中的应用

2.1 霍乱

霍乱弧菌属于革兰阴性菌，被归为甲类传染病，其发生具有传播迅速、病死率高、危害大等特点。因此，如何早期对霍乱做出准确诊断，在疫情控制中具有重要意义。姚文山等[4]研究中为建立LAMP检测，对霍乱弧菌毒素基因(ctxA)设计了4条引物，结果发现，LAMP对细菌培养物的检测灵敏度为10 CFU/ml，对鱼肉模拟样品检测灵敏度为102 CFU/ml，且在16份实际样品中检测出4份ctxA基因阳性，表明建立LAMP方法具有较高的灵敏度及特异度，可快速检测出食品中的霍乱弧菌。相兴伟等[5]研究中建立LAMP技术对水产品中的霍乱弧菌及副溶血性弧菌进行测定，结果发现，LAMP技术检测霍乱弧菌及副溶血性弧菌的灵敏度为3.12 fg，特异度为100%；对模拟食品样品检测时检测限为50 CFU/ml，对60份水产样品检测，其中6份出现LAMP阳性，结果表明，建立LAMP技术在霍乱弧菌及副溶血性弧菌的检测中灵敏度及特异度均较高，适用于霍乱弧菌及副溶血性弧菌的快速检测。

2.2 细菌性痢疾

细菌性痢疾的主要病原菌是志贺菌，是引起食物中毒的常见菌种，其中乳制品、肉类等富含蛋白质的食物是引发食物中毒的常见食品。陈传等[6]研究中建立LAMP技术对食物中的志贺菌进行检测，针对志贺菌侵袭性质粒抗原ipaH基因的6个区域设计了6条引物，结果发现，13例标准菌中仅有痢疾志贺菌LAMP产物混浊，且将痢疾志贺菌稀释106倍后仍可被LAMP技术检出，而普通技术无法检出，结果表明LAMP技术可准确、快速检出志贺菌，且特异度、灵敏度高。王伟等[7]研究中为建立LAMP技术检测，应用Primer Explorer V5软件设计针对志贺菌的保守区引物，对760例门诊腹泻患者粪便标本进行检测，结果发现LAMP检测技术具有较高的特异度及灵敏度，且其操作快速，无须特殊仪器，可在基层疾病医疗机构志贺菌的检测中广泛应用。

2.3 伤寒与副伤寒

伤寒与副伤寒属于乙类传染病，前者由伤寒沙门菌引起，后者由甲、乙、丙型副伤寒沙门菌引起，其引起的急性肠道传染病已成为主要的公共卫生问题。樊粉霞等[8]研究中为建立反转录LAMP技术，对伤寒沙门菌STY3671基因设计了6条特异度引物，研究发现134株伤寒沙门菌均呈现阳性，其余47种菌株扩张呈现阴性，在全血模拟样品检测中灵敏度为7 CFU/ml，明显高于常规检测方法，结果表明LAMP技术在伤寒沙门菌的检测中具有较高的灵敏度及特异度，为伤寒的早期诊断及预防提供依据。王鸣柳等[9]研究中为建立LAMP检测体系，对甲型副伤寒沙门菌特异保守hsdM基因设计引物，结果发现130株甲型副伤寒沙门菌均呈阳性，其他非甲型伤寒沙门菌均经扩增呈阴性，在全血模拟样品检测中灵敏度为80 CFU/ml，高于普通检测技术；对粪便模拟样本检测中，对原始样品检测下限为500 CFU/g，增菌后检测下限为0.8 CFU/g，明显高于普通检测技术，结果表明，甲型副伤寒沙门菌的LAMP检测具有较高的灵敏度及特异度，可用于甲型副伤寒的早期诊断。

2.4 其他感染性腹泻

2.4.1致泻性大肠杆菌

致泻性大肠杆菌主要指由大肠杆菌内一部分可能引起腹泻的血清型引发的肠道感染，临床上常将大肠杆菌分为肠致病性、肠侵袭性、肠出血性、肠产毒性及肠聚集性黏附5种类型，该疾病多发于儿童及老年群体，尤其以肠出血性大肠杆菌危害最大，通常患者临床症状先为水样便，逐渐转变为血性腹泻，随着病情发展，还将引发溶血性尿毒症等并发症，甚至造成患者死亡。任春阳和田杰[10]研究中为建立LAMP技术检测，对大肠埃希菌的lacZ基因序列设计了4条特异引物，结果发现，经LAMP检测，300份阳性血培养瓶中有68株大肠埃希菌，其灵敏度及特异度均为100%，且与传统培养法相比，LAMP的检出时间更短，表明LAMP技术用于大肠埃希菌的检测具有快速、成本低、灵敏度及特异度高等优势；蔡树东等[11]研究中为建立LAMP检测，对大肠埃希菌ETT2毒力岛保守基因ECs3703和HPI毒力岛的保守基因irp2分别设计了一套引物，结果发现，对大肠埃希菌ETT2及HPI毒力岛的检测限均为100 fg，明显高于常规检测，且对8株非大肠埃希菌扩增均呈现阴性，结果表明LAMP技术在大肠埃希菌ETT2及HPI毒力岛的检测中均较快速，可将其应用于疫病诊断中。

2.4.2沙门菌

沙门菌属于肠杆菌科，且属于食源性致病菌，是引起食物中毒的常见菌种。李迎晓等[12]研究中为建立LAMP检测技术，对沙门菌属fimY基因序列设计引物，结果发现，30份疑似沙门菌样本经LAMP检测有21份呈现阳性，且其可检出的最低浓度为5.6×102CFU/ml，结果表明LAMP是一种具有较强灵敏度及特异度的检测技术。贾艳艳等[13]研究中为建立LAMP快速检测方法，对沙门菌属hisJ基因序列设计引物，分别选取鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、伤寒沙门菌及其他6种食源性沙门菌进行试验，结果发现其灵敏度为102 CFU/ml，明显高于常规检测方法，特异度结果显示仅沙门菌扩增结果呈现阳性，结果表明LAMP在沙门菌hisJ基因检测中具有较高灵敏度及特异度，可用于食品沙门菌检测。

2.4.3空肠弯曲菌

空肠弯曲菌属于食源性病原菌，其主要传播途径包括乳制品、生禽肉、水源等，其宿主为家禽，该疾病多发于儿童，是引起食物中毒及格林-巴利综合征的主要病菌。齐诗蕊等[14]研究中为建立LAMP检测，对空肠弯曲杆菌马尿酸酶基因(hip O基因)设计了6套特异度引物，结果发现，LAMP技术最低检出限为6.97×102copies/μl，灵敏度明显高于常规检测，结果表明LAMP可用于空肠弯曲菌的检测，且具有较高灵敏度及特异度，适用于现场、基层检疫及医疗机构。许紫建等[15]研究中为建立LAMP检测，对空肠弯曲菌mapA基因序列设计引物，结果发现，对其他13种革兰阴性及阳性菌扩增均呈现阴性，对空肠弯曲菌DNA每个反应管检测限为100 fg，对空肠弯曲菌培养菌每个反应管检测限为7.5 CFU，结果表明LAMP可应用于动物源性空肠弯曲菌测定。

3 小结

LAMP技术具有操作简单、检测迅速、成本低且无须依赖精密仪器等优势，且可在疫情现场、基层医院实验室、一线疾控部门等广泛应用，为细菌性肠道传染病的快速诊断提供技术支持。但LAMP技术检测灵敏度及特异度高与引物的选择及设计密切相关，临床应用时应对引物严格要求，采取大量试验对其反应体系及引物检验进行优化，以确保检测的有效性。