唾液细胞外囊泡中α-突触核蛋白寡聚体诊断多系统萎缩-帕金森型的价值

曹振汤 吴瑀峰 刘亘梁 田辰 冯涛

多系统萎缩(multiple system atrophy，MSA)是一种散发性、快速进展的神经系统退行性疾病，临床表现以自主神经功能障碍、小脑性共济失调、帕金森综合征及锥体束受损为主要症状和体征，分为帕金森型(MSA-P)和小脑型(MSA-C)。目前MSA的诊断主要依靠临床表现及辅助检查[1]，其临床表现与帕金森病(PD)相似，两者鉴别存在一定困难。CIT-SPECT[2]、头MRI[3]、心脏123I-间碘苄胍摄取显像[4]等辅助检查有益于MSA和PD的鉴别，但其敏感性和特异性较低，对设备及技术要求高且价格昂贵；肛门括约肌肌电图等电生理检查对其诊断的意义尚存在争议。因此，寻找MSA生物学标记物对于MSA的诊断及鉴别诊断具有重要意义。

MSA神经病理特征主要是少突胶质细胞胞质包涵体(glial cytoplasmic inclusions，GCIs)的形成，α-突触核蛋白是GCIs的主要成分，是一种小分子胞内蛋白，由140个氨基酸组成。既往关于MSA生物学标记物的研究集中于脑脊液(CSF)和血液样本，且研究结果尚不一致。有研究结果显示，MSA患者CSF/血浆中α-突触核蛋白总量低于健康对照组[5-11]，亦有研究结果显示MSA患者CSF/血浆中[5，12-15]α-突触核蛋白总量与对照组比较无统计学差异。此外，CSF和血液样本的获取存在一定局限性，如CSF收集为有创操作，不易获得，易混杂血液而影响检测结果；血液样本处理过程中易发生溶血现象，且血小板亦会影响检测结果。近年来，唾液成为PD生物学标记物研究的理想体液，与CSF和血液样本相比，唾液具有易获得、易普及、不易受血液污染的特点。PD和MSA均属于突触核蛋白病，目前尚未检索到有关MSA患者唾液中α-突触核蛋白的研究。外泌体是细胞外囊泡的一种，研究结果示，外泌体以一种类似朊病毒的方式将大脑毒性α-突触核蛋白转运至体液中，导致PD相关症状的发生[16]，推测MSA患者体内α-突触核蛋白的转运可能与PD类似，与外泌体有关[17]。寡聚体形式的α-突触核蛋白具有神经毒性[18]，更能反映疾病的病理状态。本研究对MSA-P患者唾液中是否存在外泌体，以及唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体在MSA-P诊断中的作用进行探讨。

1 对象和方法

1.1研究对象收集2016-11-01—2017-12-31就诊于首都医科大学附属北京天坛医院神经变性病科的MSA-P患者16例，其中男9例，女7例，年龄48～76岁，平均(57.3±7.8)岁。另招募就诊患者的亲属为健康对照组，共60名，其中男26名，女34名，年龄40～78岁，平均(58.8±9.9)岁。入选标准：(1)MSA-P患者符合2008年发表的第2版MSA诊断专家共识[19]；(2)对照组不存在运动障碍疾病，无神经系统疾病史，无自身免疫性疾病；(3)签署知情同意书。排除标准：(1)严重焦虑、抑郁和精神分裂症；(2)合并心、肺、肝、肾、内分泌、免疫系统、口腔、血液系统严重疾病；(3)依从性较差者。两组间性别构成和年龄比较无统计学差异(均P>0.05)。

1.2主要试剂和仪器包括CD63抗体(BD，USA)，IgG抗体、ProteinA/G PLUS-Agarose、CD9抗体(Santa，USA)，XYCQ EV Enrichment Kit(新源长青生物科技有限公司)，分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、BCA试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)，Alix抗体(Merk&Millipore，USA)，α-突触核蛋白寡聚体蛋白(Proteos，USA)，标记生物素的捕获抗体、结合磺基修饰标签的检测抗体、稀释液35、石墨电极检测板(MSD，USA)，低温超速离心机(贝克曼Avanti J-26xp，USA)，增强型ECL化学发光液(北京康碧泉生物科技有限公司)，Western blotting电泳仪、凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)，Nanosight300(Nanosight，UK)。

1.3方法

1.3.1资料收集：收集入组对象姓名、性别、年龄、既往史、个人史，以及MSA-P患者文化程度、起病年龄、病程、家族史。

1.3.2唾液样本收集：早上9：00～11：00收集，嘱受试者安静休息10 min，禁止活动或说话，温水漱口5 min清洁口腔环境，口腔微张、头低位，收集自然分泌出的唾液至少5 mL，采用低温超速离心机4℃下以2600g离心15 min，离心后的上清液再次置4℃以下15 000g离心15 min，分装于1 mL预冷EP管，-80℃保存备用。

1.3.3外泌体的免疫纯化：将1 mL唾液样本加入5 μg IgG抗体和100 μL ProteinA/G PLUS-Agarose，4℃孵育30 min，4℃下以12 000g离心5 min，收集上清，采用XYCQ EV Enrichment Kit富集出全部细胞外囊泡，磷酸缓冲液(PBS)重悬细胞外囊泡，加CD63抗体，4℃孵育2 h，再加100 μL ProteinA/G PLUS-Agarose，置于4℃冷室环境360度旋转混匀仪上，孵育过夜，4℃下12 000g离心5 min弃上清，PBS洗涤沉淀4次，弃上清，加40 μL 蛋白上样缓冲液，4℃下12 000g离心10 min收集上清。

1.3.4外泌体的验证：运用Western blot 验证唾液细胞外囊泡是否存在外泌体的通用标记物——Alix和CD9的表达。配制10%(质量浓度)分离胶，灌胶后三蒸水封胶30～40 min，待分离胶完全凝固有明确界面后灌注浓缩胶；配制电泳缓冲液，将胶板安装于电泳槽，加满电泳缓冲液，将预染蛋白与处理好的样本依次缓慢加入胶孔底部，接通电源；取合适大小的PVDF膜，甲醇活化5 min配制转膜缓冲液，取出胶板，切去浓缩胶，制作三明治夹，将其放入转膜槽，接通电源，转膜2 h；室温封闭已经转有蛋白的PVDF膜1 h；分别进行一抗和二抗杂交后，将增强型ECL化学发光液均匀滴在PVDF膜上后，送入显影仪显影。采用Nanosight 300纳米颗粒跟踪分析仪进行唾液细胞外囊泡粒度分析：设定运行脚本，视频重复3次，视频时间60 s，视频间隔1 s。

1.3.5寡聚体α-突触核蛋白检测：应用BCA试剂盒测定唾液外囊泡内总蛋白含量。配制标准液，样本液配制，562 nm波长下测定吸光度值，绘制标准曲线，计算样本总蛋白浓度。通过标记生物素制备捕获抗体，结合磺基修饰标签(SULFO-TAG)制备检测抗体。将寡聚体α-突触核蛋白以稀释液35稀释，4倍倍比稀释6次，将50 μL 稀释后的生物素标记的捕获抗体加入电化学发光免疫检测仪石墨电极检测反应板的检测孔中，封膜；以3360g离心并反应2 h，弃液，加缓冲液清洗3次，拍板；加入稀释液35后，用封板膜封严检测反应板；以3360g离心并反应1 h，弃液，加缓冲液清洗3次，制备待测样品及标准品；稀释已经结合SULFO-TAG的检测抗体，封膜；以3360g离心并反应1 h，弃液，加缓冲液清洗3次，加入读板工作液；采用检测仪器读取石墨电极检测反应板中数据。

1.4统计学处理采用SPSS 24.0和Prism 7.0统计软件，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，两均数间比较采用t检验；计数资料采用χ2检验；ROC曲线分析唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体作为诊断疾病的敏感性和特异性，并寻找最佳临界值；采用Spearman相关性分析分析唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体水平和临床特征的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1唾液细胞外囊泡所有试剂盒富集的沉淀中均可以检测到外泌体的通用标记物——Alix和CD9表达，外囊泡主要为30～400 nm大小，其中119 nm大小的囊泡浓度最高。

2.2唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体水平MSA-P组唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体含量高于健康对照组〔(19.32±8.13)pg/ng比(1.37±0.24)pg/ng；t=3.786，P<0.01〕。

2.3ROC曲线分析应用唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体作为标记物诊断MSA-P，ROC曲线下面积为0.947(P<0.01)，最佳临界值为2.085 pg/ng，其诊断MSA-P的敏感性为93%，特异性为86%(图1)。

注：MSA-P：多系统萎缩-帕金森型 图1 唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体诊断MSA-P的ROC曲线分析

2.4相关性分析MSA-P组病程1～6年，平均为(3.06±1.73)年，起病年龄44～71岁，平均为(54.25±7.68)岁。MSA-P组唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体水平与年龄(r=0.267，P=0.336)、起病年龄(r=-0.098，P=0.727)、病程(r=0.215，P=0.441)无相关性。对照组唾液细胞外囊泡α-突触核蛋白寡聚体含量与年龄无相关性(r=0.137，P=0.381)。

3 讨论

α-突触核蛋白是由SNCA基因编码的相对分子质量为18 000～20 000的蛋白质，是路易小体(Lewy bodies，LBs)的主要成分。LBs是路易体痴呆(dementia with Lewy bodies，DLB)和PD的典型病理表现。除此之外，α-突触核蛋白也可沉积于MSA患者的少突胶质细胞内形成包涵体。DLB、PD、MSA均属于α-突触核蛋白病[20]。早期研究认为α-突触核蛋白仅存在于细胞内，而目前研究显示CSF[12]、血浆[10]、唾液[21]等细胞外体液中均可发现α-突触核蛋白，其可能通过外泌体进行分泌传播[22]。对于突触核蛋白病，α-突触核蛋白是其潜在的生物标记物。该研究对MSA患者唾液中α-突触核蛋白的诊断价值进行了探讨。

外泌体是细胞外囊泡中的一种。细胞外囊泡是细胞旁分泌产生的一种亚细胞成分，包含从细胞释放出来的多种限制性囊泡，根据囊泡的来源或者大小，分为3类：凋亡小体、微囊泡和外泌体[23]。凋亡小体体积最大，大小为1000～5000 nm，微囊泡大小为100～1000 nm，外泌体体积最小，大小约30～100 nm[24]。该研究结果显示，MSA-P患者唾液细胞外囊泡存在外泌体的通用标记物——Alix和CD9的表达，经Nanosight300粒度分析发现110 nm的唾液细胞外囊泡浓度最高，符合外泌体直径标准，表明MSA-P患者唾液细胞外囊泡中外泌体的存在。该研究结果支持既往推测[17]：MSA可能与PD存在相似的病理机制，外泌体以类似朊病毒的方式分泌传播α-突触核蛋白，导致相应部位α-突触核蛋白沉积产生相应的临床症状。外泌体可加速外源性α-突触核蛋白的聚集[25]，导致α-突触核蛋白的寡聚化[26]。

寡聚体形式的α-突触核蛋白具有神经毒性[18]。Wang等[27]研究发现MSA患者红细胞中α-突触核蛋白寡聚体水平高于对照组。外泌体中α-突触核蛋白有望成为突触核蛋白病的诊断标记物[16]。本研究结果显示，MSA-P患者唾液细胞外囊泡中α-突触核蛋白寡聚体水平高于健康对照组，运用ROC曲线分析显示其在诊断MSA-P中具有较高的敏感性(93%)和特异性(86%)，提示其有望成为MSA-P患者诊断的外周生物学标记物。关于α-突触核蛋白寡聚体较对照组升高的原因尚不清楚，研究显示外泌体可促进α-突触核蛋白的寡聚体化[26]，MSA-P患者唾液细胞外囊泡中存在外泌体，这可能是导致其α-突触核蛋白较对照组升高的原因，但具体机制有待进一步深入研究。

本研究结果显示MSA-P患者唾液细胞外囊泡中α-突触核蛋白寡聚体与年龄、起病年龄、病程均无相关性。既往研究结果亦显示MSA患者血浆α-突触核蛋白水平与疾病进展之间无相关性，其原因可能为：其一，α-突触核蛋白寡聚体具有分子异质性；其二，本研究样本量小，导致未发现相关性[11]。近年来，Shi等研究发现PD患者血浆外泌体中α-突触核蛋白与疾病严重程度存在相关性[16]，外泌体可通过血-脑脊液屏障[28]，且易从唾液等生物体液中提取[29]，被认为是神经变性疾病有希望的潜在标记物。

综上所述，本研究结果显示，MSA-P患者唾液细胞外囊泡中存在外泌体，唾液细胞外囊泡中α-突触核蛋白寡聚体高于健康对照组，其在诊断MSA-P中具有较高的敏感性和特异性，有望成为MSA-P的外周生物学标记物。未来，作者所在团队将进一步从MSA患者唾液细胞外囊泡中提取外泌体，鉴定其来源，检测其中是否存在α-突触核蛋白及其含量，若发现中枢神经系统来源的外泌体存在，则更有助于MSA发病机制、诊断、鉴别诊断的研究。此外，通过设立PD对照组，进一步分析PD患者和MSA患者唾液细胞外囊泡外泌体α-突触核蛋白寡聚体的差异，对于两者的鉴别具有重大意义。