近视性巩膜重塑相关因子研究进展△

徐福如 蒋文君 吴建峰 毕宏生

近年来，近视患病率逐年增高，已成为影响青少年视力健康的重大问题。据估计到2025年，全球青少年近视人口将达3.24亿[1]。流行病学调查研究显示，上海大学生和山东地区学龄儿童(4～17岁)近视患病率超过80%[2-3]。轴性近视是近视的主要类型，常伴随巩膜葡萄肿、脉络膜退化、视网膜萎缩和脱离以及黄斑病变等眼部病理改变，严重损害患者视力。有研究认为近视与巩膜重塑有关[4]：近视发展过程中，巩膜基质降解增加、胶原合成减少、胶原纤维直径变细、蛋白聚糖含量减少，巩膜组织变薄，眼轴进行性延长。研究表明，巩膜重塑过程受视网膜-脉络膜-巩膜级联信号调控，异常视觉信号刺激视网膜产生的信号因子经过脉络膜到达最终靶点组织巩膜，其中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及其抑制剂、生长因子、视黄酸等相关因子在近视性巩膜重塑过程中发挥了重要作用。本文就影响近视性巩膜基质重塑的相关因子及其在近视发展中的作用进行综述。

1 MMPs及其抑制剂

1.1 MMPsMMPs是一类高度保守的能够降解细胞外基质(extracellular,ECM)

一系列成分的钙离子依赖性含锌内肽酶。目前已知人源性MMPs有26种，按照底物特异性和同源性分为胶原酶、明胶酶、间质溶解素、基质溶解因子、膜性MMPs及其他[5]。

MMPs与近视发展关系密切。有研究发现，近视患者房水MMP-2高表达[13]。动物研究发现，诱导近视形成后，巩膜组织中MMP-2表达上调，此外，球后注射腺相关病毒8型包装的MMP-2过表达载体(AAV8-MMMP-2)4周后，处于正常视觉环境的小鼠巩膜组织中MMP-2上调并形成近视[6]。MMP-2属于明胶酶，主要降解巩膜ECM含量最多的Ⅰ型胶原，使胶原含量减少，巩膜生物力学功能减弱，眼球在受到相同眼压的情况下，巩膜易于变形。体外人巩膜成纤维细胞模型研究表明，极低频电磁场(0.2 mT，50 Hz)、MMPs激动剂和MMPs抑制剂能够分别促进和抑制MMP-2的表达与活性，同时下调和上调Ⅰ型胶原表达[7-8]，提示MMP-2是调控Ⅰ型胶原合成的关键因子，并在近视性巩膜重塑中发挥关键作用。

MMP-2作为某些信号通路的下游分子参与了近视形成。在近视发展过程中，巩膜组织中MMP-2、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、信号转导和转录活化因子-3(signal transducer and activator of transcription -3，STAT-3)的表达随近视程度加深明显增加，并具有时间依赖性，提示近视巩膜中IGF-1/STAT-3信号通路可能介导了MMP-2的过表达[9]。此外，Chen等[10]通过玻璃体内注射Shh信号通路激动剂(氨基末端肽SHH-N)能够诱导正常豚鼠发生近视及眼轴延长，巩膜组织MMP-2表达上调；向形觉剥夺性近视(form-deprivation myopia，FDM)豚鼠玻璃体内注射Shh信号通路抑制剂(环磷酰胺)能够延缓近视发展及使眼轴延长，巩膜组织MMP-2表达下调，两者作用均呈剂量依赖性，提示MMP-2是Shh信号通路的下游分子，该通路的激活可导致MMP-2的表达增加并影响近视形成。综上所述，MMP-2受多个信号通路的调控，在近视形成过程中表达上调，从而影响巩膜重塑。

1.2 基质金属蛋白酶抑制剂巩膜成纤维细胞分泌天然抑制剂基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是各种活性MMPs的内源特异性抑制剂，可影响巩膜基质的降解，参与巩膜重塑的过程。TIMP-2对MMP-2起激活和抑制的双重作用，TIMP-2与膜性MMP(MT1-MMP)形成复合物，能够活化MMP-2前体，TIMP-2还可抑制活性MMP-2。体外细胞模型中，低剂量重组TIMP-2可促进树鼩巩膜成纤维细胞中的MMP-2活化，呈现剂量依赖性，高剂量重组TIMP-2可抑制MMP-2活性；诱导树鼩形觉剥夺近视前，结膜下注射外源性TIMP-2，12 d后与单纯形觉剥夺近视组相比，胶原降解程度明显降低，眼轴明显缩短，近视程度明显减轻[11]。此外，转染TIMP-2基因可促进豚鼠巩膜成纤维细胞增生，抑制MMP-2的表达，促进形成新的ECM[12]。综上所述，外源性补充TIMP-2能够减少巩膜基质的降解以及延缓近视的发展。

1.3 MMPs与TIMPs的共同作用引起巩膜基质重塑的关键在于维系ECM合成与降解代谢之间动态平衡的MMPs/TIMPs的水平。Jia等[13]研究发现高度近视患者静止期房水中MMPs和TIMPs的含量同步增加；然而，实验性近视动物巩膜组织中MMPs表达增加，TIMPs含量下降，近视恢复时MMPs表达下降，TIMPs含量不变或者上升。经哌仑西平治疗后近视眼巩膜中MMP-2表达减少，TIMP-2表达增加[14]。提示MMP-2 与TIMP-2的平衡在近视的治疗过程中发挥作用。

2 生长因子

2.1 转化生长因子-β转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是与组织结构相关的多功能生长因子大家族，参与胚胎发育，ECM重塑和癌症进展等生理病理过程。TGF-β在维持巩膜成纤维细胞的正常形态和功能方面起重要作用。巩膜成纤维细胞是构成巩膜的主要细胞，合成并分泌巩膜ECM以及各种活性生物分子。人巩膜成纤维细胞表达TGF-β受体蛋白，外源性TGF-β能通过与成纤维细胞表面受体结合发挥作用。TGF-β可增加α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达，使巩膜成纤维细胞分化形成更多肌成纤维细胞，后者可通过纤维蛋白连接复合体与ECM相互作用，参与调控ECM的合成和降解。体外培养巩膜成纤维细胞中，TGF-β1、2、3可促进豚鼠巩膜成纤维细胞增殖并增加α-SMA表达，呈剂量依赖性，其中 TGF-β1促进豚鼠巩膜成纤维细胞增殖作用最强，TGF-β3增加α-SMA 表达作用最强[15]。

TGF-β1作为信号通路的上下游分子，可调控ECM主要成分Ⅰ型胶原的合成，其表达在近视发展过程中下调[16]。研究发现体外培养的FDM豚鼠巩膜成纤维细胞中，Wnt3和β-catenin蛋白表达增加，TGF-β1明显下降，Ⅰ型胶原减少排列紊乱。培养基中加入TGF-β1中和抗体后，Ⅰ型胶原排列更加紊乱。培养基加入Wnt/β-catenin通路拮抗剂后，Wnt3和β-catenin蛋白表达下降，TGF-β1表达增加，Ⅰ型胶原增加，排列规则，Wnt3/β-catenin信号通路可通过抑制TGF-β1表达，减少Ⅰ型胶原的合成，提示TGF- β1是Wnt3/β-catenin通路的下游分子，参与细胞内外跨膜信号的转导以及调节巩膜ECM重塑[17]。TGF-β1是转录因子特异性蛋白1(transcription factor specific protein，Sp1)的上游分子，在FDM豚鼠中发现Sp1-mRNA和蛋白表达减少，具有时间依赖性，且Sp1与Ⅰ型胶原蛋白表达之间存在明显正相关性，表明近视巩膜中TGF-β1-Sp1通路影响Ⅰ型胶原蛋白的产生[18]。另外，发现转基因小鼠中TGF-β1水平升高可诱导TIMP-2的高表达来抑制MMP-2的活性，最终抑制ECM的降解影响巩膜重塑[19]。

TGF-β2主要调节巩膜成纤维细胞的增殖和ECM的产生，研究发现，TGF-β2可明显促进大鼠巩膜成纤维细胞的增殖，使巩膜变厚，呈剂量依赖性[20]。但TGF-β2表达具有物种特异性，FDM小鸡和透镜诱导近视(lens induced myopia，LIM)豚鼠后极部巩膜中TGF-β2表达增加，FDM树鼩巩膜中TGF-β2表达减小[21-23]。另外，Jia等[24]发现，近视患者房水中TGF-β2 的浓度与眼轴长度呈正相关关系，提示TGF-β2 可能是近视发展和眼轴延长的关键因素。有研究报道，高度近视眼房水中TGF-β2和TIMPs水平均增加，二者水平呈正相关，提示TGF-β2促进了TIMPs的细胞代偿作用，从而减少和限制了MMPs对ECM的强烈降解[25]。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)是TGF-β最大的亚家族，已在多种眼组织中发现并在眼部发育和组织分化中起重要作用。研究证实，人巩膜中可表达多种BMPs(BMP-2、-4、-5、-RIA、-RIB、-RII)发挥调节巩膜组织稳态的作用。FDM豚鼠后极部巩膜中BMP-2和BMP-5的表达显著降低[26]。LIM豚鼠后极部巩膜BMP-2水平减少，近视恢复1周后BMP-2水平恢复至正常水平，BMP-2与透镜诱导近视和恢复期间的巩膜重塑有关。BMP-2作用于体外培养人巩膜成纤维细胞，结果显示Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增多，且糖胺聚糖与蛋白多聚糖合成增加，磷酸化Smad1/5/8表达增加，人巩膜成纤维细胞明显增殖，分化形成更多肌成纤维细胞[27]。提示近视发展中BMP-2的减少可能抑制了Smad1/5/8通路，从而引起巩膜组织中胶原和蛋白多糖减少，影响巩膜重塑。

综上所述，TGF-β的不同亚型对近视性巩膜重塑的影响及作用机制不同，主要是TGF-β1和BMP-2的减少和TGF-β2 的增加参与近视性巩膜重塑。

2.2 碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)是促进血管生成和神经营养功能的多向性生长因子，在调节巩膜成纤维细胞的生长增殖中也起关键作用。随着时间推移，b-FGF的表达在FDM大鼠中持续降低[28]，LIM豚鼠前后巩膜组织中的b-FGF均下降[22]。巩膜成纤维细胞表达b-FGF受体蛋白，外源性b-FGF可通过与成纤维细胞表面受体结合发挥作用。外源性b-FGF有效改善FDM小鸡眼轴过度伸长，并通过降低caspase-3活性减少视网膜神经细胞凋亡[29]。Tian等[30]发现外源性注射b-FGF不仅可抑制形觉剥夺对豚鼠造成的近视，增加巩膜基质中Ⅰ型胶原的合成，还可增加与巩膜重塑相关联的整合素α2和β1的表达水平，说明b-FGF在近视巩膜基质重塑过程发挥着关键作用。

2.3 肝细胞生长因子肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是具有多种生物学功能的生长因子，通过与其特异性受体(Met)结合引起酪氨酸激酶磷酸化，激活细胞内多个信号转导通路，发挥相应的生物学效应，如促进有丝分裂、促使细胞运动、抗凋亡、抗纤维化等作用，并和形态发生有关。在中国汉族高度近视患者单核苷酸多态性研究中发现，高度近视与HGF受体(Met)遗传变异有关[31]。LIM豚鼠变薄的巩膜后极部组织HGF和MMP-2 mRNA、蛋白及受体(Met)蛋白表达水平均显著高于对照组，且HGF与MMP-2水平呈正相关[32]。在体外培养的巩膜成纤维细胞模型中，进一步发现HGF以剂量依赖性方式上调MMP-2，而在HGF siRNA转染的巩膜成纤维细胞中，MMP-2蛋白表达显著降低[33]，提示HGF是豚鼠巩膜成纤维细胞中MMP-2的上游分子，HGF通过改变MMP-2的水平，影响巩膜基质的降解，调控巩膜重塑。

3 视黄酸

视黄酸又称全反式维甲酸(retinoic acid，RA)，是维生素A在体内的自然衍生物，是细胞分化增殖和程序性死亡的关键调节因子，参与胚胎发育、组织分化、肿瘤细胞的生长过程。建立外源性视黄酸诱导的近视豚鼠模型[34]，电镜发现巩膜胶原纤维数量减少，胶原直径变小，分裂明显，呈毛刷状，胶原结构稀疏，说明RA诱导巩膜发生重塑。视黄酸可能局部调节了巩膜蛋白多糖合成和降解，引起巩膜重塑。脉络膜含有较多的视黄酸，它可被运送到巩膜抑制蛋白多糖合成。有研究报道，视黄酸能够上调培养的豚鼠和人巩膜成纤维细胞中衰老关键蛋白抗原(fibulin-1)的表达，该作用与剂量具有相关性[35]。fibulin-1可与Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚素样基质金属蛋白酶(ADAMTS-1)结合，提高后者降解蛋白多糖的效率。视黄酸呈剂量依赖性增加microRNA-328表达，通过下调RPE细胞中转录因子Pax6影响近视，用Pax6表达减少的培养基处理巩膜细胞，使巩膜细胞活力呈剂量依赖性下降，细胞中Ⅰ型胶原和整合素β1水平显著降低，MMP-2表达水平上升[36]，提示视黄酸可能通过抑制转录因子Pax6的表达，增加MMP-2水平，造成基质降解增加，胶原合成减少。总之，视黄酸通过增加fibulin-1和microRNA-328的表达，影响巩膜重塑促进形成近视。

4 赖氨酰氧化酶

赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)是一种含铜的胺氧化酶，可催化胶原蛋白和弹性蛋白的交联。LOX家族包括LOX和LOX-L1-4(LOXL1-4)，是一种重要的ECM酶类，通过赖氨酸残基氧化成醛启动胶原蛋白和弹性蛋白的共价交联，胶原蛋白交联活性增强，将胶原蛋白组装成不溶性胶原纤维。由于胶原降解增加及合成减少，近视后巩膜中小直径胶原纤维数量增加，但仍存在大直径胶原纤维，因此巩膜重塑与小胶原纤维数量增加密切相关。FDM豚鼠巩膜胶原纤维直径减少，LOX和Ⅰ型胶原mRNA及蛋白水平均下降，FDM豚鼠玻璃体内注射LOX抑制剂(β-氨基丙腈)，胶原纤维直径进一步减少，极限应变增加，极限应力和弹性模量下降，巩膜生物力学减弱，弹性、应力、抵抗力均减弱，导致巩膜发生重塑，进一步加重眼球形变和近视程度；FDM豚鼠玻璃体内注射TGF-β1(LOX激活剂)后，LOX活性增加，胶原直径增加，极限应力和弹性模量增加，极限应变下降，巩膜生物力学增加，巩膜抵抗力增加，减缓眼轴延长[16]。因此明确LOX在巩膜生物力学的作用有助于寻找抵抗巩膜重塑和眼轴延长的干预方式。

5 第二信使

第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)是介导许多生理活动的重要细胞信号分子，如神经传递、免疫调节、细胞凋亡和基因调节等。两者参与视觉信号和其他神经递质转导以及胶原的合成。FDM豚鼠模型巩膜中cAMP和cGMP的水平表达增加，正常豚鼠结膜下注射AC或GC活化剂后，屈光度向近视偏移，注射AC或GC抑制剂能减缓FDM豚鼠眼轴延长[37-38]。体外培养的人巩膜成纤维细胞中，加入AC活化剂可抑制Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ胶原及其mRNA的表达，该作用可被AC抑制剂逆转。巩膜生长和巩膜重塑是眼睛发育过程中两种独立机制。AC和GC抑制剂减少了cAMP和cGMP，选择性地减弱FDM豚鼠近视的发生，不影响正常的视觉发育。以上研究表明cGMP和cGMP在近视过程中抑制巩膜成纤维细胞胶原的合成，并影响巩膜重塑。

6 结论与展望

以上相关因子均参与了巩膜基质重塑的过程，并在近视形成和发展过程中发挥作用。进一步理解相关细胞因子在近视发展进程中的作用，将有助于深入认识近视的发病机制，为精准治疗近视提供候选干预靶点。近视发病机制复杂，近视性巩膜基质重塑的相关因子具体影响通路和机制尚不十分明确。因此，未来还需进一步开展与近视性巩膜基质重塑的相关因子实验研究，深入探究其作用机制。