Runx2在成骨细胞和软骨细胞分化中作用的研究进展

吴顺义，张晓蓉

(昆明医科大学附属口腔医院正畸科，昆明 650106)

成骨可分为膜内成骨和软骨内成骨，在膜内成骨中骨由成骨细胞直接形成，而在软骨成骨中，软骨细胞最初发展并最终被骨替代。Runx2是Runt家族成员之一，它们含有共同的DNA结合runt结构域，能与核心结合因子β(core binding factor beta，Cbfb)形成异二聚体，并与共有序列TGPyGGPyPy结合[1]。实验证明在Runx2缺失小鼠中膜内和软骨内骨形成被完全中断，最终表现为骨骼和软骨样骨完全缺失[2]。Runx2能诱导间充质细胞的分化，并使间充质细胞向成骨细胞方向分化，抑制脂肪细胞和软骨细胞分化。Runx2在软骨发育中也起重要作用，并引导软骨中血管的形成和侵入。小鼠中Runx2的杂合突变会导致与人类颅骨锁骨发育不全综合征相似的表型，其表现为身材矮小、锁骨发育不全、多生牙和囟门不能闭合，并且已经有报道具有颅骨锁骨发育不全综合征的患者Runx2发生突变[3]。以上都证明Runx2在骨形成、软骨形成、骨代谢相关疾病方面有着重要作用，现对Runx2自身转录、在成骨细胞和软骨细胞的分化的调控作用以及在骨关节炎发病机制方面的作用进行综述。

1 Runx2基因的转录调控

Runx2转录自远端P1和P2启动子，具有两个不同的亚型，Ⅰ型Runx2起始序列MRIPV转录自P2启动子，Ⅱ型Runx2起始序列MASNS转录自P1启动子[4]。Ⅰ型和Ⅱ型Runx2都能在成骨细胞系细胞和软骨细胞中表达，但Ⅱ型Runx2主要在成骨细胞中表达。尽管Ⅰ型Runx2比Ⅱ型Runx2更加依赖Cbfb，但Ⅰ型和Ⅱ型Runx2在软骨细胞和成骨细胞中具有相似的功能。两种亚型都是骨骼发育所必需的，其中一种亚型缺失都将造成小鼠软骨内成骨和膜内成骨结构严重受损。研究发现Ⅰ型Runx2第一个停止密码子的ATG突变，其表达蛋白没有明显差异，说明Ⅰ型Runx2的N端氨基酸在生理功能上并不重要，在骨骼发育中P1和P2启动子对Runx2表达的调控可能比两种亚型的功能差异更重要[5]。

P1启动子已被广泛检测，体外实验证明Fosb/Jund、Tcf7/Ctnnb1、Sp1/Elk1、Dlx5、Msx2、Hoxa10能与P1启动子近700 bp区域结合，从而激活或抑制P1启动子的活性[6]。体内分析，P1启动子控制下的小鼠Runx2基因能在不成熟软骨细胞中表达，不能在成骨细胞和成熟软骨细胞中表达。在使用Runx2位点200 kb细菌人工染色体克隆的实验小鼠中发现，该基因在成骨细胞和软骨细胞中以与野生型小鼠相似的模式表达，因此，Runx2在成骨细胞和软骨细胞中的表达受增强子的调控。位于P1启动子上游的增强子已经被识别，例如，增强子的343 bp区域与最小启动子Hsp68结合，指导专门针对在成骨细胞中Runx2表达；增强子Dlx5/6和Mef2直接与89 bp核心序列结合，通过蛋白与蛋白相互作用，与Tcf7、Ctnnb1、Sp7(serine protease 7)、Sox5/6、Smad1形成增强体，增强体强烈激活增强子。但是89 bp核心序列中同源框或Mef2的突变在体内和体外均可消除增强子活性[7]。

2 Runx2对间充质细胞分化的作用

Runx2能调控印度豪猪蛋白(Indian hedgehog,Ihh)的表达，并与Sp7和经典Wnt传导相互调控，调控间充质细胞向成骨细胞方向分化，并抑制脂肪细胞和软骨细胞分化。

2.1Ihh与骨发育 Ihh缺失小鼠出生后不久即死去，软骨膜形成受损，软骨膜中无Runx2的表达[8]，说明成骨细胞分化需要Ihh，软骨内骨发育需要Runx2的表达。在Col2a1启动子环化重组酶转基因小鼠中，环化重组酶不仅在软骨细胞中表达，而且在软骨膜中也表达。使用Col2a1启动子环化重组酶转基因的Ihh条件敲除小鼠，小鼠在出生后不久就死亡，骨不形成，而且包括Runx2在内的成骨标记基因在肢体骨中无表达[9]。然而，使用Prrx1启动子环化重组酶转基因的Ihh条件敲除小鼠，虽然小鼠四肢骨骼的形成严重受损，Runx2在成骨细胞中的表达水平不到野生型小鼠的一半，但出生后能够存活，并且环化重组酶在四肢和颅骨间充质细胞中表达[10]。以上说明Ihh在骨发育中具有重要作用，Ihh的缺失会引起骨发育的严重受损。此外，Hedgehog(Hh)信号通路与其受体蛋白ptch结合可缓解精胺氧化酶的抑制作用，最终调控醇溶蛋白的生成。在使用Col2a1启动子环化重组酶的精胺氧化酶条件敲除小鼠中，Runx2表达在软骨膜外表达而不在软骨膜内表达，软骨膜细胞不能分化成软骨细胞、骨髓。因此，在软骨膜和骨髓中，Runx2的表达和骨形成需要Hh信号通路。Ihh还会影响骨形成的位置，在使用Col2a1启动子环化重组酶转基因的Ihh条件敲除小鼠中，Ihh参与了颅骨的发育，但是在颅骨中的表达比四肢骨中少[11]。使用Sp7启动子环化重组酶转基因的Ihh条件敲除小鼠骨发育正常，此实验证明Ihh仅在成骨细胞分化的早期起作用，而成骨细胞的终末分化则不需要Ihh。Hh信号通路诱导Runx2表达的机制尚未得到验证，但Hh信号通路确实能诱导Runx2表达。

2.2Runx2与间充质细胞 Runx2缺失小鼠，成骨细胞完全缺失、间充质细胞少。在成骨细胞诱导培养中，Runx2缺失颅骨细胞可分化为脂肪细胞和软骨细胞，但是成骨细胞中不存在骨形态发生蛋白2，说明Runx2缺失颅骨细胞具有向脂肪细胞和软骨细胞分化的能力[12]。此外,Runx2能抑制脂肪的形成，引进Runx2可防止脂肪细胞的分化，Runx2缺失软骨细胞会自发分化成脂肪细胞。与此相反，过氧化物酶体增殖物激活受体γ编码基因可以通过物理相互作用抑制Runx2功能，抑制成骨细胞分化；实验证明利用Prrx1启动子早期启动间充质细胞Runx2表达可诱导成骨细胞分化并且抑制软骨细胞分化[13]。因此，Runx2在决定多能间充质细胞分化中起着至关重要的作用，其表达促进成骨细胞的分化，抑制脂肪细胞和软骨细胞的分化。

2.3Sp7与骨发育 Sp7在骨发育过程中也具有重要作用，Sp7缺失小鼠成骨细胞完全缺失，而间充质细胞丰富，可分化为软骨细胞。此外，实验发现Sp7缺失小鼠Runx2能在间充质细胞中表达，从而说明Runx2是Sp7的上游基因，能直接调节Sp7表达[14]。经典的Wnt信号对成骨细胞分化也至关重要，在敲除Ctnnb1基因的小鼠中，Ctnnb1基因在成骨细胞和软骨细胞的祖细胞中被敲除，Runx2在软骨膜中表达，但在成骨细胞中完全缺失，Sp7在这些小鼠中表达缺失，软骨膜间充质细胞和颅骨间充质细胞分化为软骨细胞,类似于Sp7缺失小鼠。使用Col2a1或Prrx1启动子环化重组酶Ctnnb1基因敲除小鼠也表现出相似的表型。以上说明，骨祖细胞仍具有向成骨细胞和软骨细胞分化的能力，Sp7和经典Wnt信号抑制软骨细胞分化，并使骨祖细胞直接向成骨细胞分化。此外，Sp7和Tcf7/Ctnnb1调控Runx2的增强子活性[15]。因此，Runx2、Sp7和经典Wnt传导相互调控，使间充质细胞向成骨细胞方向分化，并抑制脂肪细胞和软骨细胞分化。大量的成骨细胞祖细胞存在于Sp7缺失小鼠和Ctnnb1基因缺失小鼠,而不存在于Runx2缺失小鼠，说明Runx2是骨祖细胞分化所必需的。与此相反，Notch信号通路可通过诱导与Runx2相互作用的转录抑制因子Hes和Hey蛋白来抑制Runx2的功能，从而抑制多能间充质细胞向成骨细胞分化，Notch信号还能促进多能间充质细胞增殖[16]。

3 Runx2在成骨细胞分化中的作用

利用2.3 kb Col1a1启动子过表达Runx2，初步检测Runx2在成骨细胞分化中的功能。实验发现使用该启动子的Runx2转基因小鼠出现骨质疏松和多处骨折，成骨细胞成熟受到抑制，皮质骨呈现编织骨结构，骨吸收增强[17]。Runx2在成骨细胞祖细胞中表达，在成骨细胞未成熟时表达量最高，成骨细胞成熟时表达量下降[18]。然而，2.3 kb Col1a1启动子在成骨细胞中是活跃的，其活性在成熟成骨细胞中也较活跃，以上研究结果表明成骨细胞中强表达的Runx2抑制成骨细胞成熟[19]。因此，Runx2在成骨细胞早期分化中起促进作用，在成骨细胞的成熟过程中起抑制作用。此外研究证明皮质骨的骨吸收增强是由Runx2诱导的Tnfsf11基因的过表达和Tnfrsf11b基因抑制引起的，皮质骨中骨细胞严重减少，提示Runx2负性调控成骨细胞向骨细胞的转化。使用2.3 kb Col1a1启动子过表达Sp7也会导致骨形成减少、骨质减少。然而，成骨细胞向骨细胞的转化并未受抑制[20]。

使用在2.3 kb Col1a1启动子环化重组酶转基因的Runx2条件敲除小鼠，进一步检测Runx2在成骨细胞分化中的功能。实验发现Runx2的成骨细胞特异性缺失，其中Runx2外显子4缺失的小鼠成骨细胞分化没有表现出明显的差异，外显子4缺失的Runx2编码了与Cbfb进行DNA结合的异二聚所必需的runt区域的一部分[21]。然而，具有成骨细胞特异性的小鼠若Runx2外显子8缺失，会因骨形成减少而出现骨质疏松症，Runx2外显子8缺失会产生一种不被截断的Runx2蛋白[22]。虽然外显子4缺失和外显子8缺失小鼠均使用来自相同来源的2.3 kb Col1a1启动子环化重组酶转基因小鼠，但不能保证环化重组酶的表达水平相同,此外，两组环化重组酶转基因小鼠的背景不同,因此环化重组酶的不同背景或表达水平可能导致表型的差异。缺失外显子8的截断蛋白保留了转录激活的能力，其活性低于野生型Runx2[23],当截断的蛋白转移到细胞核并与Runx结构域结合时，可能会干扰Runx家族所有蛋白的功能。使用在2.3 kb Col1a1启动子控制下的环化重组酶转基因小鼠有条件地敲除Runx3也会导致骨质疏松,进而说明Runx2和Runx3在成骨方面具有相似的功能[24]。但是，Runx2在分化成骨细胞中的详细作用尚需进一步研究。

4 Runx2在软骨细胞中的作用

野生型小鼠的生长板由休眠层、增殖层、前肥大层、肥大层和终末肥大层共5层软骨细胞组成，软骨细胞在休眠层和增殖层中活跃增殖，进一步分化为失去增殖能力的肥大软骨细胞。休眠和增殖层软骨细胞表达Col2a1，开始成熟的前肥大软骨细胞表达甲状旁腺激素受体和Ihh，肥大软骨细胞表达Ihh和血清X型胶原α1链，终末肥大软骨细胞表达血清骨桥素、结合涎蛋白、基质金属蛋白酶13和血管内皮生长因子A[25]。终末肥大软骨细胞层发生血管侵犯，生长板逐渐被骨所取代。Runx2在休眠和增殖软骨细胞层中表达较弱，在肥大前软骨细胞层中表达上调，在肥大和终末肥大软骨细胞层中表达进一步上调，以上研究说明Runx2在软骨的成熟中发挥重要作用。

Runx2缺失小鼠骨骼由软骨组成，软骨细胞成熟紊乱。在大多数软骨骨骼中，血清X型胶原α1链的表达严重降低，最终包括胫骨、腓骨、桡骨和尺骨在内的受限骨骼部位，出现肥大软骨细胞层矿化基质[26]。Runx2在体外正向调节软骨细胞的成熟，软骨细胞Runx2的过表达加速软骨细胞的成熟和软骨内成骨过程，Runx2的表达减少则减慢软骨细胞的成熟和软骨内成骨过程。在Runx3缺失小鼠软骨细胞成熟略推迟,Runx2缺失小鼠整个骨架完全阻塞。因此，Runx2和Runx3对于软骨细胞的成熟必不可少，Runx2起主要作用，Runx3起次要作用。在前肥大软骨细胞中，Runx2还能通过调控Ihh的表达，诱导甲状旁腺激素样激素的表达，进而抑制Runx2的表达和软骨细胞的成熟，形成负反馈调节[27]。在肥大软骨细胞中，Runx2通过激活增强子调控血清X型胶原α1链的表达。在终末肥大软骨细胞中，Runx2调控血清骨桥素、结合涎蛋白、基质金属蛋白酶13和血管内皮生长因子A的表达。Runx2还与Sp7相互作用，诱导基质金属蛋白酶13的表达，Runx2缺失小鼠完全不能通过Runx2诱导血管内皮生长因子A调控血管侵入到软骨[28]。所以，Runx2在软骨发育过程中是必需的，除能在前肥大软骨细胞、肥大软骨细胞、终末肥大软骨细胞等层次发挥重要作用外，还在血管侵入软骨中起决定作用。

5 Runx2与骨关节炎

细胞黏合素主要在永久性软骨的软骨细胞中表达，促进关节软骨细胞进入软骨内成骨，软骨细胞中Runx2过表达的小鼠，关节软骨细胞中细胞黏合素缺失，在软骨细胞中过表达的Runx2，明显抑制小鼠所有软骨的软骨细胞中细胞黏合素的表达，因此，Runx2可通过调控细胞黏合素的表达影响软骨细胞的分化。此外，Runx2诱导基质金属蛋白酶13和基质金属蛋白酶5的表达，破坏关节软骨基质。研究证明成年小鼠软骨细胞中Runx2的敲除可以减弱实验性骨关节炎小鼠模型中骨关节炎的进展[29]。Runx2和转录因子Cebpb协同诱导骨关节炎发育和基质金属蛋白酶13表达[30]。Runx2和基质金属蛋白酶13阳性细胞数量在人骨关节炎软骨软骨细胞中呈上升趋势，Runx2通过促分裂原活化的蛋白激酶信号通路增强成纤维细胞生长因子2通路诱导的基质金属蛋白酶13的表达。SIRT1(sirtuin-1)是一种NAD依赖脱乙酰酶，在人骨关节炎软骨的软骨细胞中表达，调控Runx2和基质金属蛋白酶13的表达[31]。既往研究报道组蛋白去乙酰化酶4水平降低，人类骨关节炎软骨中Runx2、Ihh、基质金属蛋白酶13、血清X型胶原α1链的表达增加，Runx2、Ihh、基质金属蛋白酶13、血清X型胶原α1链、基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶5的表达与组蛋白去乙酰化酶4的量呈负相关[32]。此外，Runx2基因位点中的两个单核苷酸位点已被确定为骨关节炎易感位点[33]，目前公认的软骨细胞的成熟参与了骨关节炎的发病机制，其中Runx2是致病基因之一。

6 Cbfb对Runx2的调控

研究表明Cbfb缺失小鼠会由于胎肝造血功能缺失而死亡，同时小鼠Runx2也缺失,表明Runx2表达需要Cbfb的参与,通过治疗Cbfb缺失小鼠有缺陷的造血作用延长其生存时间，从而证明Cbfb是骨骼发育、Runx2的有效DNA结合和Runx2的转录激活能力所必需的[34]。使用Sp7环化重组酶转基因小鼠、Col2a1环化重组酶转基因小鼠、Prrx1环化重组酶转基因小鼠和Twist2环化重组酶转基因小鼠条件敲除Cbfb，发现Cbfb是软骨细胞增殖、成熟和成骨细胞分化所必需的[35]。此外，Cbfb通过抑制泛素化介导的降解，在Runx蛋白的稳定中发挥重要作用。然而，不同Runx家族蛋白对Cbfb的依赖程度不同[36]，在颅骨和四肢软骨组织中依赖水平为Runx1>Runx3>Runx2，肢体软骨组织中的依赖水平高于颅骨。在Cbfb条件基因敲除使用Twist2 Cre敲入小鼠，Runx2缺失小鼠颅骨和锁骨的发育受到严重干扰。然而,正常小鼠中Cbfb敲除其软骨内骨化只是严重延迟。因此，Cbfb对软骨内骨化的作用大于膜内骨化作用，膜内骨化相对软骨内骨化更需要Runx2参与[37]。

Cbfb通过选择性剪接形成Cbfb1和Cbfb2两个功能异构体，Cbfb1缺失小鼠Cbfb2上调,而Cbfb2缺失小鼠Cbfb1不存在,表明Cbfb1受Cbfb2的控制，而Cbfb1对软骨细胞和成骨细胞的分化以及Runx2的DNA结合更为有效[38]。因此，两种亚型都具有不同效率的拮抗功能，能调节Runx2到合适的生理水平，从而在骨骼发育过程中发挥重要作用。

7 小 结

骨代谢过程中Runx2、Sp7、Ihh、Wnt信号相互调节，引导多能间充质细胞向成骨细胞分化，抑制脂肪细胞和软骨细胞分化。与此同时，Runx2是软骨细胞成熟所必需的，Runx2和Ihh共同调节软骨细胞的增殖和成熟。Runx2通过调节成骨细胞的分化来增强骨形成，而通过降解引起骨关节炎，是骨关节炎的重要病因机制之一。综上所述，Runx2在骨代谢中发挥重要作用，是骨关节炎形成的重要基因之一。Runx2是成骨细胞和软骨细胞分化的关键转录因子，其在转录和蛋白水平上的家族特异性调控对于骨质疏松症和骨关节炎的治疗具有重要意义。