丹参酮ⅡA和Notch信号通路与肾纤维化的研究进展

张力之，李 均

(遵义医学院珠海校区中药应用与基础研究重点实验室，广东 珠海 519000)

肾纤维化是肾组织受损后人体自身修复的结果，也是各种慢性肾脏病发展到终末期肾病的共同通路[1]。近年来，肾纤维化进程中肾小管上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)逐渐受到关注，其进展速度直接影响肾纤维化进程。丹参的脂溶性成分丹参酮ⅡA被广泛用于肾纤维化的临床治疗，对改善肾脏纤维化和保护肾脏功能的效果明显。丹参酮ⅡA可通过干预EMT进一步影响肾纤维化的产生与进展，具体过程可能与多条导致肾纤维化的信号通路有关。Notch信号通路是近年来信号通路的研究热点，与肾纤维化关系密切[2]。阻断Notch信号通路可抑制EMT、减少肌成纤维细胞的生成，并可进一步减缓肾脏组织纤维化的进展[3]。但丹参酮ⅡA与Notch信号通路之间的关联性及具体影响机制仍需进一步深入探讨。现对丹参酮ⅡA和Notch信号通路与肾纤维化的研究进展予以综述。

1 Notch信号通路与肾纤维化

1.1Notch信号通路概述 Notch信号通路是由多种信号分子参与的高度保守的信号通路，广泛存在于各种生物进化过程。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体、细胞内转录因子CSL(C-启动子结合因子1/重组信号结合蛋白-Jk、无毛抑制器、滞后蛋白1的合称)、效应物及相关调节分子等组成，参与调控细胞增殖、分化、凋亡等关键环节，并精确调节细胞之间的信息交流[4]。目前，存在于人体内的Notch受体有Notch1～Notch4，其中Notch1～Notch3常表达于神经和心脏、肾脏、肝脏等，Notch4则表达于上皮细胞[5]。Notch受体由细胞外区、跨细胞膜区、细胞内区3部分组成，细胞外区由表皮生长因子重复序列以及含半胱氨酸的Lin/Notch重复序列组成，能够识别并结合Notch配体，并激活信号途径；细胞内区由锚蛋白重复序列、含谷氨酰胺的结构域以及PEST结构域组成，通过将Notch信号转导至细胞核内部来调节细胞的生命活动。目前，明确的人体内跨膜蛋白Notch配体是Jagged1、Jagged2、Delta-like 1、Delta-like 3、Delta-like 4，可在信号通路激活后结合Notch受体，经过两次蛋白裂解，形成Notch蛋白胞内活化域，随后进入细胞核结合细胞内转录因子CSL，激活通路下游的Hes-1、Hey等靶基因，使蛋白产物大量表达，调控细胞周期，影响细胞的增殖、分化和凋亡[6-10]。

1.2肾小管EMT 肾小管EMT与肾纤维化关系密切。EMT导致组织中成纤维细胞增多，成纤维细胞发生功能和表型改变，转变为表达α平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞，从而产生大量的细胞外基质，促使肾纤维化的产生[11]。与肾小管EMT相关的常见因子有转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、结缔组织生长因子等。上皮钙黏素被认为是EMT的特征性蛋白，细胞内上皮钙黏素含量降低是EMT发生的特异性标志[12]。在EMT过程中，细胞上皮钙黏素减少，大量间充质蛋白出现(如α平滑肌肌动蛋白、波形蛋白等)，使细胞黏附能力下降，导致大量上皮细胞迁移，加速肌成纤维细胞生成。锌指转录因子是EMT过程的关键分子，细胞中锌指转录因子蛋白含量增加可导致上皮钙黏素的表达下降，从而加重纤维化[13-14]。

1.3Notch信号通路与肾间质纤维化 Notch信号通路可通过调控肾脏组织细胞的增殖、发育、凋亡等影响肾间质纤维化的发生。Notch信号通路参与肾小管EMT过程可能与许多信号通路(TGF-β信号通路、Wnt信号通路、表皮生长因子受体信号通路、血管内皮生长因子信号通路等)相关，通过影响EMT过程中上皮钙黏素、锌指转录因子及相关调控因子等影响肾纤维化过程。在肾小管上皮细胞EMT过程中,Hey1基因受TGF-β和Jagged1共同调控，TGF-β可以参与诱导早期Hey1基因的表达,Jagged1则调控后续Hey1基因的表达。Hey1基因激活可引起信号通路下游目的蛋白大量表达，减少细胞间黏附力，加快EMT的进展，可见，Notch信号通路可与TGF-β信号通路协同串联，共同调控肾小管上皮细胞的EMT过程[15]。Aoyagi-Ikeda等[16]通过细胞实验发现，细胞纤维化时，Notch信号通路的激活是TGF-β诱导纤维化细胞产生α平滑肌肌动蛋白以及生成细胞外基质的必备过程。当Notch信号通路激活后，配体Jagged1表达产物大量增加，导致大鼠上皮细胞中α平滑肌肌动蛋白过量表达，细胞纤维化加重。肾间质纤维化病理改变中，TGF-β1可增加Notch1、Notch4、Jagged1、Jagged2等基因的表达，从而调控EMT产生[17-18]。TGF-β信号通路下游分子Smad3可通过与Notch信号通路下游细胞内转录因子CSL的结合影响信号通路的转导[19]。具体过程可能是TGF-β活化后，促进Notch信号通路中HES-1蛋白表达，此过程可被CSL阻滞，Notch蛋白胞内活化域及Smda3发生效应后形成多聚物，调节HES-1蛋白表达。当CSL与Notch蛋白胞内活化域共存时，Smad3可与CSL结合，进而取代DNA上CSL/Notch蛋白胞内活化域靶点[20]。Bielesz等[21]研究认为，Notch信号通路可以加快TGF-β信号通路中Smad3的活化过程，Smad3能够增加结缔组织生长因子的表达，抑制上皮钙黏素表达，同时提高细胞内α平滑肌肌动蛋白的表达，进而促进EMT的发生，加重肾间质纤维化程度[22]。3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t-丁酯{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-Butyl Ester，DAPT}是Notch信号通路细胞内因子γ分泌酶抑制物，通过降低Notch信号通路活性，抑制Notch蛋白胞内活化域和HES-1的表达，阻断Notch信号通路的活化，进而抑制大鼠肾小管上皮细胞间质转化[23]。进一步研究发现，Notch信号通路与TGF-β1信号可在肾间质纤维化过程中互相影响，γ分泌酶抑制剂能阻断TGF-β1调控的近端肾小管上皮转分化过程，TGF-β1及转分化有关基因均被γ分泌酶抑制剂所抑制，肾间质纤维化过程受到影响，表明阻断Notch信号通路后，TGF-β1信号通路也会被阻断，肾小管上皮细胞EMT过程将会受到抑制[24]。此外，当Notch信号通路被激活后，锌指转录因子蛋白大量表达，从而促进TGF-β1介导的EMT发生，并加重纤维化，表明Notch信号通路和TGF-β1信号通路存在协同作用，可以共同调控组织纤维化[25-26]。同样，Notch信号通路与Wnt信号通路、血管内皮生长因子信号通路也存在类似的联系。朱天琦等[27]研究发现，Notch信号通路抑制剂作用于人肾母细胞瘤细胞后，Notch信号通路中Notch1和Jagged1以及Wnt信号通路中Wnt1和β联蛋白表达都明显降低，还发现DAPT可抑制细胞中血管内皮生长因子的表达。Lin等[28]研究发现，糖尿病肾损伤细胞模型中足细胞、人胚肾细胞(HEK293)以及动物模型肾组织中均可检测到Notch信号通路的过表达，这可能与血管内皮生长因子等因素有关。

其他器官组织的EMT过程也有Notch信号通路参与调控细胞组织的纤维化。肝脏纤维化的研究证实，DAPT能够延缓大鼠肝脏EMT的发生，改善肝脏细胞纤维化[29-30]。一方面，DAPT干预治疗大鼠肝星状细胞内Notch信号通路活性降低，信号转导被抑制；另一方面，TGF-β、锌指转录因子和间质细胞表达产物生成减少。DAPT可上调上皮钙黏素的表达，上皮钙黏素表达增加可减慢细胞发生EMT的速度。肝脏损伤模型中Notch和Hedgehog信号通路可通过介导EMT共同调控肝星状细胞。肝星状细胞中Notch信号通路与Hedgehog信号通路同时被激活，Hedgehog信号通路激活后，可进一步促进Notch信号通路的信号转导。当特定阻断Notch信号通路后，细胞内Hedgehog靶基因Gli1和Ptc表达产物减少,Hedgehog信号通路转导被抑制。阻断Hedgehog信号通路中Smoothened发现，细胞内Notch2、Jagged1以及Notch信号通路的靶基因表达下降，说明肝纤维化过程中Notch信号通路和Hedgehog信号通路共同参与肝星状细胞的EMT，且两者之间可相互影响，共同决定EMT的发展进程[31]。肺纤维化过程中使用DAPT可以抑制Notch信号通路活化，降低解整合素金属蛋白酶17的表达，减少局部活性氧类的产生，降低肺组织氧化损伤，从而改善肺纤维化程度[32]。于秀文和曾林祥[33]阻断Notch信号通路转导发现，肺组织中肌成纤维细胞生成受到抑制，肺纤维化进程得到缓解。可见，Notch信号通路与组织纤维化关系密切，激活Notch信号通路可导致组织细胞EMT的产生，促使纤维化的发生。

2 丹参酮ⅡA和Notch信号通路与肾纤维化

2.1丹参酮ⅡA与肾纤维化 丹参酮ⅡA又称丹参醌Ⅱ或丹参醌ⅡA，分子式为C19H18O3，是一种橘红色针状结晶，熔点209～210 ℃，主要存在于丹参的干燥根和根茎，易溶于有机溶剂，微溶于水。近年来，随着对丹参脂溶性成分丹参酮ⅡA的深入研究，发现丹参酮ⅡA能够抗炎抗氧化，同时能明显抑制成纤维细胞增殖，减少细胞外基质产生，延缓肾间质纤维化过程，改善肾组织纤维化。丹参酮ⅡA可以抑制纤维连接蛋白、胶原蛋白Ⅲ、胶原蛋白Ⅳ和肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化蛋白1和CXC趋化因子配体1的蛋白质以及信使RNA的表达，同时可以抑制5/6肾切除大鼠肾组织中TGF-β/Smad和核因子κB信号的激活，从而进一步抑制肾脏组织EMT的产生[34]。赵斐等[35]研究证明，丹参酮ⅡA能够维持肾小管上皮细胞形态的稳定，防止细胞向成纤维细胞发展，并在一定程度上抑制TGF-β1诱导的细胞增殖和分泌Ⅰ型胶原的作用，从而达到防治肾纤维化的目的。唐锦辉和占成业[36]的研究发现，丹参酮ⅡA能够起到延缓肾间质纤维化和保护肾脏功能的作用，与下调细胞内TGF-β1的表达、抑制成纤维细胞生成和转化以及减少相关胶原蛋白的产生等密不可分；通过丹参酮ⅡA的干预发现，干预组肾间质纤维化程度比模型组减轻，肾组织中TGF-β1、α平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达均下降。王俏等[37]建立丹参酮ⅡA干预治疗糖尿病肾病大鼠模型的研究发现，丹参酮ⅡA具有保护肾脏和延缓糖尿病肾病进展的作用，具体功效可能与丹参酮ⅡA强大的抗氧化活性有关；细胞组织中总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶表达、超氧化物歧化酶活性可随丹参酮ⅡA的使用提高；与此同时，丙二醛总量有所下降，肾小球基膜增厚和硬化得到改善，肾纤维化程度得以减轻。丹参酮ⅡA磺酸钠作为丹参酮ⅡA磺酸化后产物，具有良好的溶解性以及抗纤维化和改善循环等功效，常用于临床治疗。丹参酮ⅡA磺酸钠能够下调血小板源性生长因子D，并上调血红素加氧酶1的表达，抑制间质细胞增生和表型转化，从而抑制大鼠肾间质纤维化的产生和进展[38]。周儒兵等[39]通过丹参酮ⅡA磺酸钠干预糖尿病大鼠的实验发现，丹参酮ⅡA磺酸钠注射液治疗组α平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和TGF-β1的表达均较糖尿病模型组下调，且肾间质纤维化程度得到改善。唐云海和朱春玲[40]认为，波形蛋白可能参与促炎反应和促肾间质纤维化过程。丹参酮ⅡA磺酸钠可通过降低波形蛋白在肾小管间质的表达减少细胞外间质的生成，从而缓解肾间质纤维化。

除肾纤维化外，丹参酮ⅡA对其他器官和组织也有抗纤维化作用。对肺纤维化的研究发现，丹参酮ⅡA不仅可通过减少肺间质纤维化期间炎性细胞的产生和炎性因子的释放来减少肺组织局部氧化应激反应，抑制诱导型一氧化氮合酶和环加氧酶2的表达；还可通过抑制大鼠TGF-β1、Smad2和Smad3信号途径转导，抑制肺间质纤维的产生[41]。对肝脏组织纤维化大鼠的研究发现，丹参酮ⅡA可通过抑制肝纤维化组织血管新生的方式起到抗肝纤维化作用，其关键环节是抑制肝组织血管内皮生长因子与缺氧诱导因子1α的信使RNA与蛋白的表达[42]。对心肌纤维化大鼠的研究发现，丹参酮ⅡA能够抑制心肌间质成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，通过下调结缔组织生长因子的合成，减少心脏肌成纤维细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成，从而明显降低心肌间质胶原沉积，改善心肌纤维化程度[43]。

2.2丹参酮ⅡA与Notch信号通路 Notch信号通路与肾纤维化有直接关联，丹参酮ⅡA通过调节各信号通路以及各环节细胞因子和蛋白产物对肾纤维化起保护作用。目前，丹参酮ⅡA调节Notch信号通路影响肾纤维化发生的具体调节机制尚不清楚。将大鼠随机分为正常组、模型组、丹参酮ⅡA组、DAPT组及丹参酮ⅡA联合DAPT组(联合给药组)的丹参酮ⅡA配伍DAPT抗大鼠肾纤维化的研究显示，各单一给药组和联合给药组大鼠肾组织纤维化程度较模型组轻；免疫组织化学结果显示，各给药组Notch蛋白胞内活化域、Hey1平均光密度值明显低于模型组，以联合给药组效果最佳；蛋白质免疫印迹结果显示，各给药组重组信号结合蛋白-Jk、ColⅠ蛋白相对表达较模型组明显降低，联合给药组效果最为明显，由此可见，丹参酮ⅡA可缓解肾间质纤维化过程中胶原纤维的合成,其作用机制可能与抑制Notch蛋白胞内活化域、重组信号结合蛋白-Jk、Hey1在肾组织表达以及影响Notch/Jagged信号途径转导相关[44-45]。但丹参酮ⅡA是否能够促进DAPT抑制Notch信号通路激活，从而协同延缓RIF产生的具体机制尚不明确。何琼笑和赵峻峰[46]随机将大鼠心肌缺血再灌注模型分为模型组、丹参酮ⅡA组和DAPT组，结果显示模型组心肌内活性氧类水平和乳酸脱氢酶含量显著升高，Notch1、Hes1、缺氧诱导因子1α的信使RNA和蛋白的表达明显增高，与模型组相比，丹参酮ⅡA组和DAPT组中Notch1信使RNA的表达以及Notch1、Hes1和缺氧诱导因子1α蛋白的表达明显下降，认为丹参酮ⅡA通过抑制Notch信号通路进一步调控抗氧化应激反应，从而对大鼠心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。

3 小 结

目前，对丹参酮ⅡA与肾纤维化的研究主要集中在Wnt/β联蛋白、TGF-β/Smad、缺氧诱导因子1α/血管内皮生长因子等信号通路。丹参酮ⅡA能够参与以上信号转导途径，并减轻肾纤维化程度，延缓肾纤维化产生，保护肾脏功能。在肾纤维化过程中，Notch信号通路与以上信号通路相互串联，但目前国内外对丹参酮ⅡA是否能够参与Notch信号通路调节肾纤维化以及其具体调节机制尚不清楚。其他器官组织中，丹参酮ⅡA能通过调节Notch信号通路影响细胞生长、凋亡等。目前，有关丹参酮ⅡA与Notch信号通路及其通路信号因子在肾纤维化过程中具体关联的研究正在进行。丹参酮ⅡA对肾纤维化过程中Notch信号通路具体调控机制的深入研究，有助于进一步阐述丹参酮ⅡA抗肾纤维化的作用机制，为丹参酮ⅡA临床治疗慢性肾脏病提供更多的理论依据。