农业废弃物柑橘皮渣堆肥工艺优化及其微生物群落结构演替规律研究

刘智萍，夏家帅，王 晗，周月明，2*，陈猷鹏，郭劲松，晏 鹏，2

（1.重庆大学 城市建设与环境工程学院，重庆 400045;2.中国科学院 重庆绿色智能技术研究院，重庆 400714)

重庆是我国柑橘主产区之一，2016年产量高达242.6万吨[1]。柑橘除少部分用于鲜食外，多用于加工，产生45%～60%的柑橘皮渣[2]。柑橘皮渣富含香精油、色素、黄酮类、果胶、维生素B及维生素C等物质[3]，提取这些物质仍没有解决后续废渣的处理问题。皮渣还可以烘干作动物饲料，但能耗较高[4]，国内应用较少。国内柑橘皮渣主要进行填埋处理。柑橘皮渣含水量高达80%，pH低于4，填埋后产生大量酸性液体，破坏土壤结构、污染水体和空气[5]。因此，急需开发一种经济环保的柑橘皮渣资源化利用方式。

柑橘皮渣富含有机质及氮磷钾等营养元素。张云茹等[6]以柑橘皮渣和稻壳等为原料进行了平菇栽培试验，证明了柑橘皮渣制备有机肥的可行性。但柑橘皮渣含有大量果胶、纤维素及木质素等大分子物质，微生物降解困难[7]。赵建等[8]筛选出可在高温条件下快速降解果胶及纤维素的地衣芽孢杆菌，堆肥温度高达70℃。亦有研究表明，堆肥中复合微生物菌群的协同作用大大提高了堆肥效果[9]。

堆肥以微生物代谢为核心[10]，物质的降解受碳氮比（C/N）、含水率、pH、通气性、粒径大小及温度等的影响，科学地控制这些参数有利于提高堆肥效果。杨文卿等[11]利用正交试验得到了污泥/猪粪添加聚丙烯酸钠混合堆肥的最优工艺参数。沈建兵等[12]通过正交试验探讨了C/N、含水率、加菌量对污泥堆肥的影响，并获得了最优工艺参数。但这些研究均未对优化后的工艺参数进行验证。

本研究进行了柑橘皮渣堆肥工艺的优化试验，研究影响堆肥效果的重要可调控因素[13]：原料含水率、C/N、pH、加菌量对堆肥效果的影响，以总养分含量为肥效评价指标，得到柑橘皮渣堆肥的最优工艺条件，并在最优工艺条件的基础上进行柑橘皮渣堆肥中试研究，验证优化效果。同时，利用高通量测序技术分析堆肥过程中微生物群落结构变化，揭示堆肥过程中细菌、真菌、放线菌及优势菌属的演替规律。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 柑橘皮渣及辅料

柑橘皮渣取自长寿园区尚疏坊果园，粉碎至20～30 mm块状，辅料麸皮取自当地面粉厂，柑橘皮渣及麸皮的主要成分见表1。

表1 柑橘皮渣及麸皮的主要成分（%）Tab.1 The main ingredients of citrus peel and bran（%）

1.1.2 接种菌剂

接种菌剂为实验室自主制备的菌系J，该菌系由实验室通过高温限制碳源筛选得到的耐高温皮渣降解复合菌系[由芽孢杆菌（Bacillus）、青霉（Penicillium）及喜热裂孢菌（Thermobifida）等组成]及购自北京康源绿洲有限公司的EM（Effective Microorganisms）功能菌等比例混合得到。经预实验证明该菌系J可快速降解果胶、纤维素并提高堆体温度。

1.2 试验设计

1.2.1 基于正交设计的柑橘皮渣堆肥小试研究

根据前期预实验、正交试验设置原料含水率（water content，W）、C/N、石灰量（Lime quality，L）及加菌量（microorganism dosage，M）4个对堆肥效果影响显著的因素，每个因素选取3个水平，以总养分含量为评价指标，进而确定堆肥的最优工艺参数。正交因素及水平见表2。正交试验设置9个处理，分别记为P1～P9，原料均为40 kg，堆置于自制带孔（Φ=1 cm）整理箱中40 d，前2周每2 d翻堆1次，2周后每5 d翻堆1次。

表2 正交试验因素水平表Tab.2 The levels of the orthogonal factors for composting

1.2.2 柑橘皮渣堆肥中试研究

在正交试验得到的最优工艺基础上，于重庆市诚冠有机肥有限公司进行中试研究，验证最优工艺堆肥效果。堆肥原料为20 t，堆成高1 m左右的堆垛，堆置40 d。堆置前2周，每1～2 d翻堆1次，2周后5～7 d翻堆1次。

1.3 测定项目与方法

堆置期间，每日测定堆肥中心及环境温度；于0 d，5 d，10 d，17 d，27 d，40 d进行多点取样，混合均匀后，测定其果胶[14]、纤维素[15]、含水率、pH、氮（N）、磷（P）、钾（K）[16]及有机质含量，并保存部分混合鲜样于-80℃冰箱，送至上海美吉生物医药科技有限公司，采用Illumina公司的Miseq PE 250平台进行高通量测序。

1.4 数据分析

采用Excel 2010、SPSS 20.0统计软件处理试验所得数据，采用Origin 9.1软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 柑橘皮渣堆肥小试研究

2.1.1 堆肥过程中温度变化

温度是堆肥中的重要控制指标，它既表征微生物的活性也决定着微生物的活动过程[17]。由图1可见，各处理时间的温度变化曲线均有明显的升温期（0～2 d）、高温期（2～10 d）、降温期（10～17 d）及腐熟期（17～40 d）。堆置2 d时，温度均超过45℃，其中处理组P6和P8升温较快，在3 d时达到60℃，而P7升温略慢，可能是因为初始pH及含水率均较高，影响微生物活性。堆置5 d时，各处理组的温度均达到最高值，其中P6（69℃）＞P7（64℃）＞P8（62℃），其余均在60℃以上，并且在高温期（＞55℃）持续时间较长的处理组有P6（9 d）、P7（5 d）、P8（7 d），达到无害化卫生标准要求[18]。高温期后温度逐渐下降，进入降温腐熟期。

图1 各处理组不同时间堆肥温度的变化Fig.1 The temperature changes in compost of different treatment

2.1.2 堆肥过程中总养分含量变化

总养分含量（N+P2O5+K2O）为重要的肥效指标。由图2可见，在堆置过程中，各处理的总养分含量呈持续增长趋势。堆肥前期增长较快，5 d时增长最快的处理组为P5（36%），其次为P6（32%）。进入降温期后总养分含量增长减缓，最终所有处理的总养分含量均达到国家标准，其中最高处理组为P6（6.01%），最低为P7（5.29%）。这可能是接种功能菌系后，堆肥温度较高，水分及有机质快速减少，堆体质量快速下降，总养分含量逐渐升高[19]。

图2 各处理组不同时间堆肥总养分含量的变化Fig.2 The total nutrient content changes in compost of different treatment

2.1.3 正交试验结果与分析

表3为不同工艺参数下有机肥的总养分含量。其中Ki为每个因素在第i水平下的总养分含量之和，总养分含量越大，相应的Ki越大。R为极差，极差越大，表示该因素对总养分含量影响越大。结果表明各因素对总养分含量的影响主次顺序为B＞C＞D＞A，其中B因素影响最显著，A因素的极差最小，故以A项为误差进行方差分析。结果见表4，其中B因素有显著性差异，A因素、C因素与D因素无显著性差异。通过K值大小可判断，最优因素组合为A1B3C2D2（W55%C/N25L10M3%)。对于B因素（C/N），微生物分解有机物较适宜的C/N为25左右[20]，C/N过高，微生物需要多次代谢才能消耗过量的碳，从而降低了降解速度[21]，原料C/N由25升至30，对应的K值由5.92%降至5.42%，即最终总养分含量也降低了8.40%。所以，当原料含水率为55%、C/N为25、石灰投加量为10 g/kg、加菌量为3%时，所得有机肥的肥效最优。

表3 正交试验结果Tab.3 The results of orthogonal experiments

表4 方差分析结果Tab.4 The results of ANOVA

2.2 柑橘皮渣堆肥中试研究

在最优工艺条件（W55%C/N25L10M3%）下，进行柑橘皮渣堆肥中试研究，并与小试数据对比分析，考查工艺优化的可靠性和稳定性。

2.2.1 堆肥中试温度变化

考虑到中试规模较大，堆体不同层次温度变化差异较大，故分别测定堆体表层、中心及底部温度，并与小试研究温度变化（去极值后平均）相比较，具体见图3。

图3 中试温度的变化Fig.3 The temperature changes in pilot test

中试温度变化趋势与小试相似，均有升温期、高温期及降温期，中试表层最高温度可达到73℃，堆心最高温度可达67℃，明显高于小试温度61℃，并可维持高温期（堆心温度55℃以上）25 d，堆肥化效果及无害化效果显著高于小试研究。这可能是由于中试规模较大，有更好的保温效果，同时工艺的优化增强了微生物的活性[22]。不过中试温度分布不均，前期表层温度最高，中心次之，底部温度最低。这是由于前期易降解有机质被微生物快速消耗，堆体氧气含量成为限制因素[23]，氧气由外至内降低，影响好氧微生物活性。21 d后，堆体中主要物质为难降解的纤维素类物质，微生物活动减弱，需氧量降低，且含水率降至40%以下，堆料较初期更干燥、疏松，氧气传递情况改善，堆体的保温效果成为限制因素[24]。

2.2.2 堆肥中试各理化参数变化

中试研究各理化参数的变化趋势与小试研究相似，故在此以小试的最优值作对照（CK）。中试各理化参数的变化见表5。

表5 中试研究各理化参数的变化Tab.5 The changes of physical and chemical parameters in pilot test

由表5可知，随着堆置的进行，堆料含水率、果胶、纤维素及有机质含量显著减少，而总养分含量逐渐增加。由于中试温度更高，有机质消耗与水分散失更快，各指标较小试均有一定提升。

果胶含量在5 d时显著降低，降解率达到86.36%，40 d时降解率为96.75%，优于小试结果的93.22%，说明接种的菌系可快速降解果胶。其中含水率随时间增加呈降低趋势，至40 d时为24.25%，优于小试效果。由于初期有机酸的产生pH有所下降[25]，之后由于氨化作用及矿化作用又逐渐上升[26]，最终趋于稳定。纤维素含量也大大降低，至40 d时，纤维素含量仅为16.34%，降解率达到54.71%，优于小试结果的47.19%。中试有机质的消耗始终维持较高的水平，至40 d时有机质含量为54.32%。堆至40 d时总养分含量显著提升，达到6.48%。

2.3 堆肥微生物群落结构的演替

目前关于堆肥过程中微生物群落结构的研究大多限于对细菌的研究[27]，而堆肥过程中真菌、放线菌对木质纤维素的降解起重要作用[28]，却少见文献报道。笔者分析了柑橘皮渣堆肥过程中细菌、真菌及放线菌的总丰度及各自优势种群的相对丰度变化情况。

2.3.1 细菌、真菌及放线菌丰度的变化

由图4可知，细菌（Bacteria）与真菌（Fungi）的总体丰度较高，堆肥过程中呈小幅度波动，而放线菌（Actinomycetes）总体丰度较低，在堆肥过程中先升高后降低，说明接种的菌系组成稳定。堆至第5 d时细菌丰度有所降低，第17 d后逐渐升高并趋于稳定；真菌丰度在第5 d时略有升高，于第17 d时略有下降，随后又逐渐升高并趋于稳定；而放线菌初期丰度很低，随着堆肥的进行丰度逐渐升高，第17 d时达到顶峰，之后放线菌丰度稍有降低并趋于稳定。

图4 堆肥中物种丰富度的变化Fig.4 The changes of species abundances in compost

2.3.2 细菌群落结构的变化

由图5可见，堆肥初期细菌中优势菌属为假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas）、泛菌（Pantoea）及Bacillus，且进入高温期后优势逐渐扩大，同时鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium）开始快速增殖。堆至第17 d进入降温期，Pseudoxanthomonas及Pantoea丰度快速下降，此时优势菌属变为Bacillus及Sphingobacterium，并随着堆肥的进行优势不断扩大，堆至第27 d时，二者相对丰度之和达到72%。堆肥末期，鞘氨醇单胞菌（Sphingobium）开始大量增殖，逐渐占据绝对优势地位。据报道Pseudoxanthomonas[29]，Pantoea[30]及Sphingobacterium[31]具有高温下降解木质纤维素的能力；Bacillus可抵抗高温等不良环境[32]，并拥有良好的果胶及纤维素降解能力[8]；Sphingobium则有在贫营养环境下的良好耐受能力[33]以及在好氧条件下降解木质素[34]的能力，与其在后期营养贫瘠、pH较高时占据绝对优势相呼应。

图5 堆肥中细菌群落结构的变化Fig.5 The changes of Bacteria community structure in compost

2.3.3 真菌群落结构的变化

高温真菌对好氧堆肥中木质纤维素的降解有重要的作用[35]。由图6可知，初期真菌的优势菌属为Penicillium，进入高温期后其丰度显著降低，而嗜热子囊菌（Thermoascus）迅速增殖，占据绝对优势地位，直至堆肥结束。其中，Penicillium具有很强的纤维素[36]及果胶降解能力[37]，但其本身不耐高温[38]，而Thermoascus可在较大的温度（30℃～80℃）及pH（2～10）范围下高效降解半纤维素[39]，这与其在整个堆肥过程中占据优势地位相呼应。

图6 堆肥中真菌群落结构的变化Fig.6 The changes of Fungi community structure in compost

2.3.4 放线菌群落结构的变化

放线菌是一类在木质纤维素降解中占据重要地位的革兰氏阳性细菌[40]。由图7可知，初期放线菌的优势菌属为糖单胞菌（Saccharomonospora）及Thermobifida，进入高温期后二者优势显著扩大，特别是Saccharomonospora，其相对丰度达到58%；第17 d时，Saccharomonospora丰度降低，此时优势菌属为Saccharomonospora、Thermobifida及纤维微菌（Cellulosimicrobium）；至堆肥后期，拟诺卡菌（Nocardiopsis）迅速增殖，与Saccharomonospora成为后期的优势菌属。据报道，Saccharomonospora及Thermobifida具有良好的耐碱耐热及降解半纤维素的能力[41]，其中Thermobifida还可降解纤维素[42]，Cellulosimicrobium则拥有降解果胶、纤维素及固氮的能力[43]，而Nocardiopsis拥有降解各种木质纤维素的能力[44]。虽放线菌丰度比真菌和细菌丰度低，但其对高温期及降温期木质纤维素的降解有重要的作用。

图7 堆肥中放线菌群落结构的变化Fig.7 The changes of Actinomycetes community structure in compost

2.3.5 堆肥过程中微生物主要功能分析

柑橘皮渣堆肥的技术难点是果胶和木质纤维素的降解[45]。果胶会直接影响脱水效果及堆肥的正常进行。试验表明，接种菌系之后，在大量Bacillus与Penicillium等的作用下，果胶迅速分解，皮渣中的结合水转化为自由水，随着堆体温度的升高而散失，堆肥得以顺利进行。木质纤维素在堆肥高温阶段逐渐软化[46-47]并在Pantoea，Thermoascus及Saccharomonospora等的作用下迅速降解，随着堆肥进入降温腐熟期，木质纤维素在Sphingobium、Thermoascus及Nocardiopsis等的作用下持续分解。

3 结论

（1）小试正交试验以总养分含量为评价指标，堆肥工艺的最优工艺参数为原料含水率55%、C/N比25、石灰投加量10 g/kg、加菌量3%。

（2）基于最优条件的中试研究效果显著优于小试研究，各指标均有一定提升，其中总养分含量达到6.48%，较小试研究的6.01%有显著提升。

（3）堆肥过程中细菌、真菌、放线菌及其优势菌属随堆肥时间不断演变，Bacillus、Penicillium及Thermobifida在堆肥前期占据优势，Sphingobium、Thermoascus、Nocardiopsis则在后期占优。

（4）Bacillus及Penicillium对堆肥前期果胶的快速降解起主要作用，木质纤维素在不同时期均存在降解，是多种优势菌属协同作用的结果。