淫羊藿苷对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用及机制研究*

闫 磊 梁 军 董建将 孙晓冬 邵新然 蔡克瑞（牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011）

缺血性脑血管病死亡率很高，脑缺血-再灌注是其主要的病理生理过程。淫羊藿是传统中药，淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿中的主要活性成分。ICA具有调节免疫、抑制肿瘤、改善心脑血管功能、抗氧化损伤和抑制肝纤维化等功能［1-3］。本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注模型，探索ICA对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级大鼠40只，体质量300～400 g，雌雄不限（牡丹江医学院实验动物中心提供），动物许可证号：SYXK（黑）2015-007。所有大鼠饲养于标准条件下，12 h明暗交替，室温控制在20～25℃，自由摄食饮水。

1.2 试药与仪器 淫羊藿苷（陕西西安飞达生物技术有限公司，批号20120516；纯度98.56%），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、髓过氧化物酶（MPO）、一氧化氮合酶（NOS）检测试剂盒（南京建成生物工程有限公司），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血清白细胞介素-1β（IL-1β）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 分组与造模 将大鼠随机分成4组，即假手术组、模型组、ICA低剂量组（30 mg/kg）和ICA高剂量组（80 mg/kg），每组10只。术前给药7 d，ICA低剂量组给予腹腔注射ICA（30 mg/kg）2 mL，ICA高剂量组给予腹腔注射ICA（80 mg/kg）2 mL，假手术组和模型组给予相同体积0.9%氯化钠注射液，每日1次。制备脑缺血模型［4］：采用颈总动脉夹闭法。大鼠术前禁水4 h，禁食12 h，仰卧位固定后10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，取颈部正中切口，钝性分离颈总和颈内、外动脉，结扎颈外动脉。夹闭颈总动脉后撤掉动脉夹恢复血流后缝合。假手术组仅剥离但不夹闭颈总动脉。大鼠术后均同等条件下正常饲养，24 h后处死大鼠提取脑组织标本。

1.4 观察指标 1） 测定脑组织 GSH-Px、SOD、MPO活性和MDA含量：将10%缺血侧大鼠脑组织匀浆应用GSH-Px、SOD、MPO、MDA试剂盒操作，测定GSHPx、SOD、MPO活性和MDA含量。测定脑组织NO含量、NOS活性［2］将 10%组织脑匀浆 4℃下离心 10 min（3 000 r/min），取上清液。应用硝酸还原酶法测定NO含量，应用比色法NOS活性。2）测定脑组织TNF-α的含量：将缺血侧大鼠脑组织匀浆后应用ELISA检测试剂盒测定脑组织中TNF-α含量。3）测定血清IL-1β含量［5］：取颈静脉血 2 mL，室温静置 1 h，离心 10 min（3 000 r/min），分离血清，-80 ℃保存，按 ELISA 检测试剂盒说明书步骤操作测定血清IL-1β含量。

1.5 统计学处理 应用SPSS for windows 16.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析统计学方法对所得数据进行分析，组间两两比较LDS检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑组织GSH-Px、SOD活性的比较 见表1。与假手术组比较，模型组GSH-Px、SOD活性差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，ICA低剂量组和ICA高剂量组大鼠脑组织GSH-Px、SOD活性明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组大鼠脑组织 GSH-Px、SOD、MDA、MPO水平比较（x±s）

2.2 各组大鼠脑组织MDA含量、MPO活性比较 见表1。脑缺血-再灌注24 h后，与假手术组比较，模型组MDA含量、MPO活性差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，ICA低剂量组和ICA高剂量组大鼠脑组织MDA含量、MPO活性明显减低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠脑组织NO、NOS、TNF-α含量比较 见表2。脑缺血-再灌注24 h后，与假手术组比较，模型组 NO、NOS、TNF-α 含量差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，ICA低剂量组和ICA高剂量组大鼠脑组织NO、NOS、TNF-α含量明显减低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组大鼠脑组织NO、NOS、TNF-α和血清IL-1β含量比较（x±s）

2.4 各组大鼠血清IL-1β含量比较 见表2。脑缺血-再灌注24 h后，与假手术组比较，模型组差异有统计学意义 （P＜0.01）；与模型组比较，ICA低剂量组和ICA高剂量组大鼠血清IL-1β含量明显减低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨 论

脑缺血-再灌注损伤是在脑缺血基础上再灌注导致的脑组织进一步损伤，最终会导致神经细胞坏死或凋亡，其机制尚未完全明确。目前的研究表明，脑缺血-再灌注损伤主要与炎症反应、兴奋性氨基酸、细胞内钙超载、氧自由基和细胞凋亡等几方面有关［6］。缺血组织再灌注后，氧自由基可以引起微血管和实质器官的损伤；兴奋性氨基酸、细胞内钙超载和细胞凋亡可以对脑组织产生神经毒性作用；炎症因子的释放可以加重炎症反应和细胞凋亡，并进一步增加脑水肿。因此，如何抑制脑缺血-再灌注氧自由基损伤、抑制神经毒性作用和抑制炎症反应是已经成为目前脑缺血疾病方面研究的热点。

淫羊藿属于小檗科淫羊藿属植物。《神农本草经》中首次记载了淫羊藿具有强筋骨、滋补肾阳、祛风湿等功效，以其干燥叶入药，味辛、甘，性温。ICA是传统中药淫羊藿的有效药理成分。有研究发现ICA能够上调神经生长因子的表达，营养神经细胞，改善记忆功能［7］，因此ICA在抗神经损伤领域有广阔的研究前景［7-8］。但是其是否能在脑缺血-再灌注损伤中起到神经保护作用及机制尚未得到阐述。

GSH-Px和SOD是机体内清除自由基的重要抗氧化酶，其活性高低是反映机体清除氧自由基、抗氧化能力的重要指标。SOD在全身各组织广泛分布，SOD可以与反应形成H2O2，H2O2经过过氧化物酶和GSHPx的催化生成水，从而清除自由基，保护细胞免受氧化性伤害。有研究显示［9-11］，脑缺血-再灌注模型中，上调SOD活性可有效减轻脑缺血再灌注引起的组织损伤。MDA是不饱和脂肪酸过氧化作用的终产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、坏死、细胞膜通透性增加，造成细胞损伤。MDA含量可以间接反映出细胞受自由基损害和过氧化的程度。通常将GSH-Px活性、SOD活性和MDA含量联系起来作为评估机体清除氧自由基、抗氧化能力指标。本实验发现ICA可以增高脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织GSH-Px、SOD活性，减低MDA含量，增强机体清除氧自由基的能力，抑制氧自由基损伤，具有神经保护作用。

NO是广泛分布于神经组织中的一种新型生物信息传递分子。在脑缺血再灌注损伤中，NO具有神经保护和神经毒性双重作用。机体健康状态时NO可以通过增强突触传递，抑制受体以及舒张血管增加脑血流量等机制起到脑神经保护作用；但体内NO积聚时，NO可通过损伤线粒体、钙超载、细胞凋亡、介导兴奋性氨基酸的毒性及氧自由基损害等机制对脑组织产生神经毒性作用，加重脑缺血损伤。NO合成的限速酶是NOS，其活性是决定NO发挥保护或损伤双重作用的关键因素［4，10］。本实验发现ICA可以减少脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织NO含量、NOS活性，抑制NO增高导致的神经毒性损伤，具有神经保护作用。

炎症反应是脑缺血再灌注损伤影响因素中的重要的环节［13-14］。MPO是中性粒细胞的特异性标志物，MPO的活性可以反映炎症反应的程度［13］。 TNF-α、IL-1β 都是主要的促炎因子［14］：TNF-α的激活在脑缺血炎症反应中起着核心作用。TNF-α可以介导炎症级联反应，诱导巨噬细胞、内皮细胞、胶质细胞及炎症递质等的表达，加重脑损伤［15］；IL-1β可以诱导中性粒细胞黏附于内皮细胞及其基质并通过内皮进入缺血区，通过释放氧自由基、堵塞微血管等途径加重脑损伤［5］。本实验发现ICA可以减少脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织MPO活性、TNF-α含量和血清IL-1β含量，抑制炎症反应，具有神经保护作用。

综上所述，本实验通过建立大鼠脑缺血-再灌注模型，发现ICA对大鼠脑缺血-再灌注损伤具有神经保护作用，其机制可能与增高GSH-Px、SOD活性、降低MDA含量抑制氧自由基损伤；降低NO含量、NOS活性，抑制神经毒性损伤；降低MPO活性、TNF-α、IL-1β含量抑制炎症反应损伤有关。