热毒宁注射液对甲型流感病毒感染小鼠肺组织炎症和相关炎症因子水平的影响*

刘 玉 谢 纬 贾 丹 张小瑾 祝庆华 陈 生

（广东省深圳市中医院，广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518003）

流感病毒感染是上呼吸道相关疾病发病的一个重要原因，也是导致人急性肺损伤而引起死亡的主要原因之一。目前发现的流感病毒有甲、乙、丙3种类型，其中甲型流感病毒是目前导致流感感染的主要病原体。由于流感病毒抗原的变异，新的病毒株以及新的亚型不断形成，从而使得甲型流感病毒可以反复多次突破人类的过往免疫保护进而引起流行性感冒中小型流行甚至世界性的大流行［1］。世界范围内每年因季节性的流感导致了300～500万人罹患流感相关的严重疾病［2］。据报道仅在2016年底至2017年初的不到5个月的时间里，中国有1 258名患者感染H7N9禽流感病毒，死亡率高达41%［3］。研究表明流感疫苗只是部分地起作用［2］。故此流感预防策略及治疗方法显得非常的重要，近年来越来越多的国内外学者把研究方向聚焦于流感的防治。流行性感冒属于中医学“时行感冒”的范畴，其主要病因为风热毒邪外感肺卫，未得及时祛除，风热毒邪内传，进而内袭于肺，致使风热毒邪蕴结肺部。其基本的病理机制为风热外袭、热毒蕴肺。常以辛凉解表、清热解毒为主要治法和治则。基于循证方法的前期临床试验证实，热毒宁注射液治疗流感具有较好的临床疗效［4］。为了深层次地了解其作用机制，本实验通过制备小鼠甲型流感病毒性肺损伤模型，研究热毒宁注射液对实验小鼠肺组织病理改变、血清及肺组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）水平的影响，以图通过抗炎症反应渠道初步探讨热毒宁注射液治疗流感的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级的BALB/c小鼠共48只，平均体质量波动于14～17 g，由中国军事医学科学院实验动物中心提供，许可证编号：SCXK-（军）2016-0035。饲料批号：SCXK（京）2016-0017。

1.2 病毒株 本实验所用甲1型流感病毒鼠肺适应株FM1由广州医科大学呼研所病毒室提供，先由10日龄的鸡胚尿囊腔进行接种培养传代，采用微量血凝试验进行病毒效价的滴定，其中血凝效价在1∶640以上者可供本试验所用。在正式试验前进行预实验测定小鼠的病毒半数致死剂量（LD50），正式试验采用50倍的半数致死剂量（50LD50）的病毒液。

1.3 试药与仪器 热毒宁注射液购自江苏康缘药业股份有限公司（批号1511525945）；利巴韦林注射液购自河北石家庄石药集团欧意药业有限公司 （国药准字H20123033）。小鼠IL-1β ELISA试剂盒、小鼠TNF-α ELISA试剂盒、小鼠IL-6 ELISA试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）。超净工作台（BCM-1300A，苏州安泰空气技术有限公司）；石蜡切片机（Leica RM2235）；酶标仪（Multiskan Ascent）；超低温冰箱（BC-163D，海尔集团）；低温高速离心机（Microfuge 22R，美国Beckman公司）；倒置显微镜（Nikon-TE300，Leica dmil公司）；全自动生化分析仪（7020，日本日立公司）；精密电子分析天平 （上海良平仪器仪表有限公司）；超纯水器（Millpore）；微量加样器（德国 Eppendorf公司）；一次性注射器、眼科镊、平皿、小鼠灌胃针等。

1.4 分组与模型制备 实验动物采用随机数字表法将48只BALB/c小鼠按随机数字表法分成正常对照组、模型对照组、热毒宁注射液组、利巴韦林注射液组各12只。实验动物进行适应性饲养3 d后称取体质量，除正常对照组小鼠外，其余各组小鼠均制备病毒感染实验动物模型。具体模型制备方法流程如下：首先行乙醚轻度麻醉，之后每只小鼠鼻内滴种50LD50的流感病毒液50 μL。正常对照组小鼠在同等条件下的动物房进行隔离饲养，并按上述流程鼻腔接种0.9%氯化钠注射液 50 μL。

1.5 干预方法 各治疗组在病毒接种感染后的第24小时进行给药处理，连续给药5 d。热毒宁注射液组每次给予热毒宁注射液7.2 mL/（kg·d）腹腔注射；利巴韦林注射液组每次给予利巴韦林注射液150 mg/（kg·d）腹腔注射；正常组和模型组给予同步腹腔注射0.9%氯化钠注射液每日1 mL。各组实验小鼠在标本采集前最后1次给药后予禁水、禁食8 h。

1.6 标本采集与检测 分别在造模后第3日和第5日采集标本，每次每组取6只，将实验小鼠称质量后，通过摘除眼球法取血，血液采集于促凝管中，立即放入低温离心机中，4 000 r/min离心5 min，离心后取上层血清存于EP管中，放入-80℃冰箱中冷藏以备本实验ELISA检测。之后采取颈椎脱臼的方法将小鼠处死，在无菌操作台上将小鼠仰卧位固定，用医用消毒酒精将其颈部及胸腹部消毒，无菌外科剪剪开胸骨，打开胸腔，取出整个肺脏组织，立即用微量天平称取肺组织的质量，计算各个小鼠的肺指数 （肺质量/体质量×100%）。取左侧肺组织，将之放入4%的多聚甲醛固定液中进行固定，行常规脱水后石蜡包埋并进行HE染色。根据相关的参考文献［3］进行实验小鼠的肺组织病理学评分。剪取右肺50 mg置于EP管中，加入1 mL的0.9%氯化钠注射液，采用组织匀浆机将肺组织进行充分地研磨，之后储存于-80℃冰箱以备本实验相关指标的ELISA检测所用。采用ELISA法进行急性肺损伤实验小鼠的血清和肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的测定。具体的检测程序严格遵循ELISA试剂盒的说明书进行操作。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（x±s）表示。采用单因素方差分析（ONEWAY ANOVNA），组间比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠肺指数比较 见表1。模型组第3和第5日的肺指数均高于正常组（P＜0.05）。药物治疗后第3日和第5日，各治疗组与模型组差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后第5日，热毒宁注射液组与利巴韦林注射液组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组肺指数比较（x±s）

2.2 各组小鼠肺组织病理改变观察 见图1。正常组：肺组织未见异常，气管和肺泡结构清晰，管腔内无渗出物，血管无扩张充血，基本无明显的炎性细胞浸润。模型组：小鼠肺泡组织结构不清，部分肺泡萎陷不张，肺泡间隔明显增宽，肺间质和肺泡内有蛋白质水肿液及大量炎症细胞浸润，肺微血管充血、出血、微血栓。利巴韦林注射液组：肺泡结构较模型组有改善，肺泡萎陷、充气不良，较模型组有一定好转，肺间隔内炎细胞渗出有一定好转。热毒宁注射液组：肺泡萎陷、充气不良明显改善，肺间质和肺泡水肿不明显，肺泡间隔见少量纤维性渗出。

图1 各组小鼠肺组织病理改变（HE染色，100倍）

2.3 各组小鼠血清及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的比较 见表2。流感病毒感染小鼠后，模型组血清及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均较正常组明显升高，且在第5日达峰值；治疗后第3日和第5日，热毒宁注射液组、利巴韦林注射液组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均较模型组有所降低（P＜0.05）；治疗第3日和第5日，热毒宁注射液组血清和肺组织TNF-α水平较利巴韦林注射液组均降低更明显（P＜0.05）；治疗第3日，热毒宁注射液组血清和肺组织IL-1β、IL-6水平较利巴韦林注射液组均降低更明显（P＜0.05）。

表2 各组小鼠血清及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较（x±s）

3 讨 论

自2016年10月至2017年2月，中国有1 258名患者感染H7N9禽流感病毒，其致死率为41%［3］。每年因季节性的流感导致300～500万人罹患流感相关的严重疾病，目前疫苗只是部分有效［2］。流感病毒主要侵入机体呼吸道黏膜上皮细胞，引起内皮细胞大量释放炎症因子，介导过度的炎症反应，进而细胞产生空泡、变性，并迅速产生子代病毒体扩散至邻近细胞，重复病毒增殖周期，最终导致肺组织损伤［5］。本实验证实流感病毒感染小鼠的肺组织中出现黏膜水肿、充血、淋巴细胞浸润等，且流感病毒性肺炎模型小鼠的肺部炎症病变程度与肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6的水平相一致。

研究表明，纯化的流感病毒神经氨酸酶可诱导巨噬细胞释放 IL-1、TNF-α［6］，全病毒可诱导外周血单个核细胞产生 IL-1、IL-6 和 TNF-α［7］，流感病毒诱导机体免疫反应产生的TNF-α、IL-6可直接作用于细胞、微血管等，造成组织损伤［8-9］。另有研究证实，流感病毒性肺炎模型小鼠的肺部炎症病变程度与细胞因子TNF-α、IL-6 直接相关［10-12］，用 TNF-α 抗体治疗能减轻肺部炎症病变［13］。本研究选取流感病毒感染初期早期启动的特异性细胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β为检测指标来观察热毒宁注射液对流感病毒感染小鼠的炎症反应的影响，结果发现，小鼠在感染初期血清及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈上升趋势，采用热毒宁注射液和利巴韦林注射液均能降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，尤以热毒宁注射液更为显著，提示减轻由炎性因子过度释放引起的病理损伤，改善肺指数状。

甲型H1N1流感属于中医学 “瘟疫病”“疫疠病”“瘟病”的范畴，风热犯卫证或热毒袭肺证为初期多见证候。热毒宁注射液具有清热、疏风、解毒的功效，故在卫生部颁布的 《甲型H1N1流感治疗方案 （2010年版）》［14］中，被推荐用于治疗流感患者。前期临床研究证实热毒宁注射液可明显缩短流感患者病程［4］，降低流感患者外周血炎性因子［15］。热毒宁注射液主要成分包括环烯醚萜类、有机酸及黄酮类成分等［16］。给实验大鼠静脉注射热毒宁注射液后，通过药代动力学的方法发现其循环系统中存在热毒宁注射液的46种化合物（19种环烯醚萜类，16种有机酸，11种黄酮类）［17］。 现代药理学研究表明，热毒宁注射液组方中的金银花、栀子、青蒿具有解热抗炎、抗氧化、抗病毒等作用。栀子苷在体外能有效抑制甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的CPE，在体内能有效减轻甲型H1N1流感病毒对小鼠肺部的损伤。大量体外试验研究表明青蒿素类药物具有抗病毒作用，对甲型流感病毒等具有较好的抑制作用。基于活性导向的研究表明，金银花不同成分对H3N2和H1N1甲型流感病毒神经氨酸酶均有抑制作用［18-20］。

综上所述，热毒宁注射液具有抗流感病毒感染的作用，能够减轻肺组织病变程度，正向调节炎症因子，减缓流感感染小鼠的炎性反应，降低肺组织和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的表达。