桃仁对糖尿病大血管纤维化大鼠蛋白激酶B信号通路的影响

周 玉，刘国涛，卢增珍，徐 阳，王 军

糖尿病后期合并肾、视网膜、神经等并发症是糖尿病的主要危害，其中下肢血管病变是糖尿病诸多慢性并发症中的一种[1]，主要病因是动脉粥样硬化。血管纤维化是其组织学改变的主要特征之一[2]。前期研究发现糖尿病足患者血管病变是以内膜的纤维性增厚为主，脂质沉积以纤维成分所占比例大[3]。机体纤维化的过程主要是细胞外基质的沉积和降解出现失衡，成纤维细胞等活化成熟分泌胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质过多导致。此过程受多种基因及信号通路的调控，蛋白激酶B (protein kinase B,亦称AKT) 信号通路是介导组织纤维化的重要通路[4-5]，这一通路是否介导糖尿病大血管纤维化，有待于研究。本研究将从AKT信号通路角度，以其关键分子AKT和p-AKT为切入点，并用中药桃仁为干预因素，研究糖尿病大鼠大血管纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠200只，清洁级，2月龄，体质量（180±20）g。由天津实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK-（军）2012-0004。

1.2 药物 桃仁颗粒由天津中医药大学第一附属医院颗粒剂药房制备，1 g颗粒剂相当于生药20 g。3 g桃仁颗粒剂溶解于200 mL蒸馏水中，形成含生药0.3 g/mL的药液备用。大鼠的等效剂量约为人体的6倍，按人体重60 kg计算，当人桃仁用量为30 g/d时，即0.5 g/(kg·d)，大鼠生药用药剂量约为3.0 g/(kg·d)，即颗粒剂水溶液10 mL/(kg·d)。

1.3 主要试剂与仪器 AKT、p-AKT一抗：北京博奥森生物技术有限公司。β-actin内参抗体：天津赛尔生物有限公司。辣根过氧化酶（HRP）标记二抗：天津赛尔生物有限公司。Epgiadients PCR仪：Eppendorf公司。ABI7500 fast荧光定量PCR仪：Life Technologies公司。转膜仪：上海东玺制冷仪器设备有限公司。灌胃针、各型注射器、10 mL玻璃瓶、载玻片、止血钳、刀柄、刀片、剪刀、镊子、试管、吸管、EP管等由海门市春博生物实验器材厂提供。

1.4 动物造模及分组给药

1.4.1 造模 2型糖尿病大血管纤维化大鼠造模方法见表1。

表1 2型糖尿病大血管纤维化大鼠造模流程表

2型糖尿病大血管纤维化大鼠造模成功标志：造模组出现平滑肌细胞排列紊乱，内皮细胞肿胀，内膜、中膜层明显增厚，血管腔狭窄，并见大量泡沫细胞，纤维帽，弹力纤维断裂，胶原纤维玻璃样变，甚至出现胆固醇结晶，钙盐沉着等，证实糖尿病大血管纤维病变造模成功。

1.4.2 分组给药：最终除去意外死亡、造模失败和验证造模是否成功损耗大鼠共39只，剔除试验。最终分组：空白对照组（n=29）、模型对照组（n=34）、早期干预组（n=34）、高剂量组（n=32）、低剂量组（n=32）。除空白对照组不予干预外，其余各组分别给予生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃、桃仁颗粒剂水溶液10 mL/(kg·d)灌胃（早期干预组从2型糖尿病模型制作成功开始药物干预）、桃仁颗粒剂水溶液20 mL/(kg·d)灌胃、桃仁颗粒剂水溶液10 mL/(kg·d)灌胃，连续干预7周。每组采用简单随机数字表法随机选取5只大鼠，用10%的水合氯醛0.3 g/100 g麻醉，根据股动脉搏动情况，确定股动脉的位置和走行方向。将皮肤沿股动脉走向纵向切开，用纹式钳把周围组织钝性分离，以暴露股动脉鞘。用眼科镊沿着血管走向钝性分离出股动脉约4～5 cm，两端剪断。PBS冲洗，平均分成两部分，一部分采用4%多聚甲醛进行固定，另一部分置于无菌冻存管中，-80 ℃冰箱保存。

1.5 检测指标 （1）大鼠股动脉病理学改变。将取材得到的一部分组织采用4%多聚甲醛进行固定，石蜡包埋，常规组织切片及HE染色，光学显微镜下观察股动脉的病理学改变。（2）实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，QPCR）检测大鼠股动脉AKT mRNA表达。提取总RNA（Trizol法提取），反转录，反应体系为25μL，12.5μL SYBR Mix，1μL cDNA，上下游引物各 1μL，ddH2O体积9.5μL，合计25μL。仪器为ABI Step-plus 系统。GAPDH作为内参。AKT引物序列上游为：AGCATGGAGTGTGTGGACAG，下游为：TACAGATGATCCATGCGGGG，长度150 bp。Gapdh内参上游：TGTGAACGGATTTGGCCGTA，下游：GATGGTGATGGGTTTCCCGT，长度208 bp。（3）免疫组化检测AKT表达。采用SP法，按照试剂盒说明书进行。依次对切片进行脱蜡、梯度酒精水化、抗原修复、血清封闭、一抗孵育、二抗标记、DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、干燥、封片等主要步骤。（4）Western blotting检测AKT及p-AKT表达。常规方法低温研磨提取组织上清，利用BCA蛋白定量法对各样本的蛋白浓度进行定量。SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭。加入一抗 AKT（1:1000），p-AKT（1:1000），4 ℃过夜，缓慢摇动。洗去非特异结合的一抗。加入辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1 h，缓慢摇动。洗去非特异结合的二抗。二抗孵育完毕后，按照ECL发光液试剂盒说明书均匀滴加显色液，放入凝胶成像仪中显影。蛋白条带用Image Lab软件分析。比较各组蛋白条带灰度值的大小。

1.6 统计学方法 统计计算均用SPASS 20.0统计软件进行，计量资料以均数±标准差（）表示。本研究数据不符合正态性或方差不齐，采用多组独立样本非参数检验（Kruskal-Wallis H检验），P＜0.05（双侧检验）认为差异具有统计学意义。组间两两比较先将数据进行排秩，以秩次作为测量变量，用LSD法两两比较，P＜0.05（双侧检验）认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠股动脉HE染色 空白对照组大鼠股动脉血管平滑肌细胞排列规则。模型对照组大鼠股动脉血管平滑肌细胞排列紊乱，可见大量泡沫细胞、纤维帽及胆固醇结晶，血管内皮细胞肿胀，内膜、中膜层明显增厚;早期干预组血管平滑肌细胞排列较规则，血管内皮细胞见肿胀，内膜、中膜层增厚;低剂量组血管平滑肌细胞排列不规则，多数血管内皮细胞肿胀，内膜、中膜层明显增厚;高剂量组血管平滑肌细胞排列较规则，部分血管内皮细胞肿胀，血管内膜、中膜层增厚。见图1。

图1 各组股动脉HE染色

2.2 QPCR检测大鼠股动脉AKT mRNA表达 与空白对照组比较，模型对照组、药物干预组AKT mRNA表达上调（P＜0.05或P＜0.01）；与模型对照组比较，药物干预组AKT mRNA表达均上调，且以早期干预组和高剂量组为著（P＜0.01），见表2。

2.3 免疫组织化学检测股动脉中AKT蛋白表达 空白对照组大鼠血管内膜、血管内皮细胞及中膜平滑肌细胞中有散在黄色物质，呈弱阳性改变；模型对照组可见大量棕黄色物质表达呈强阳性反应；中药干预7周后，早期干预组和高剂量组可见散在黄色物质呈弱阳性反应，提示AKT表达下降；低剂量组可见黄色物质表达呈阳性反应，提示AKT表达下降，见图2。

表2 各组大鼠股动脉AKT mRNA的表达比较（）

表2 各组大鼠股动脉AKT mRNA的表达比较（）

注：与空白对照组相比，aP＜0.05，aaP＜0.01；与模型对照组相比，bP＜0.05，bbP＜0.01

图2 免疫组织化学检测各组股动脉中AKT蛋白表达

2.4 Western blotting检测股动脉中AKT、p-AKT蛋白表达 与空白对照组比较，模型对照组、药物干预组AKT、p-AKT表达均显著上调（P＜0.01）；与模型对照组比较，药物干预组AKT、p-AKT表达均上调（P＜0.01或P＜0.05）；药物干预组两两比较显示，AKT、p-AKT表达无差异（P＞0.05），见表3、图3。

表3 治疗后各组大鼠股动脉AKT和p-AKT蛋白表达的比较（ ）

图3 Western blotting检测各组大鼠股动脉中AKT、p-AKT的表达

3 讨论

糖尿病大血管病变是糖尿病后期严重的并发症，髂动脉、股动脉以及下行大血管的动脉粥样硬化、狭窄、堵塞造成了下肢的缺血，严重影响患者的运动能力和生活质量。糖尿病大血管病变的病理改变主要为内膜、中膜层厚度增加，管腔狭窄，管壁顺应性降低，内膜粥样斑块形成致管腔进一步狭窄，直至完全闭塞，产生临床症状。其中血管纤维化是病变发生发展过程中的重要表现形式，它的发生与长期慢性的高血糖、脂质代谢紊乱、内皮功能紊乱、血液流变学改变等多种因素有关。研究显示，高血糖与高血脂的毒性作用、蛋白质非酶糖基化、内皮功能障碍等因素联合作用于血管壁，导致平滑肌细胞增殖，胶原过度表达，这种高糖诱导的过度表达与血管纤维化、硬化高度相关[6]。

PI3K/AKT信号通路由PI3K和AKT两部分组成，PI3K普遍存在于体内各类细胞，在细胞存活与分化、细胞生长、运动和凋亡等多种生理和病理过程中起重要作用[7]。AKT是PI3k下游中一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是原癌基因c-akt 编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有AKT1、AKT2、AKT33个异构体。AKT的氨基酸末端具有PH结构域，能与细胞膜附近的PI （3，4，5）P3结合形成复合体，复合体与3-磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，PDK1) 结合可促进AKT的氨基酸末端的PH结构域磷酸化。p-AKT是AKT的磷酸化状态，AKT只有转变为p-AKT才能发挥生物学功能。

大量文献研究表明，PI3K/AKT信号通路和组织纤维化密切相关[8]。AKT信号通路的激活刺激下游间质纤维结缔组织（细胞外基质）增生，成纤维细胞产生细胞外基质蛋白，细胞外基质产生和降解失衡，细胞外基质异常沉积，即发生纤维化的病理改变。如PI3K-AKT-m TOR通路在肺组织纤维化过程中具有重要作用[9]，NGF可通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活，促进LX2细胞凋亡进一步导致肝纤维化[10]，苦参碱调控p-AKT/AKT蛋白表达抑制大鼠心肌肥厚的作用[11]。

本次研究结果显示，在糖尿病大鼠股动脉纤维化模型中，模型对照组大鼠股动脉AKT mRNA表达较空白对照组明显升高，使用中药干预后有不同程度的下降，并且以早期干预组和高剂量组下降明显，两者相比无统计学差异。低剂量组也有下降，但下降不明显。同时，通过免疫组化和Western blotting方法对AKT和p-AKT进行检测，得到了基本一致的结果。因此可以得出，在糖尿病大鼠纤维化模型中，纤维化的产生和AKT信号通路相关。中药桃仁干预可抑制这一过程，具体来看，中药低剂量（10 mL/(kg·d)）早期干预和高剂量（20 mL/(kg·d)）干预效果较好，两者相比无明显差异。关于桃仁在糖尿病大血管纤维病变的作用，我们前期研究中发现，以桃仁为主药的桃核承气汤能抑制TOLL样受体通路表达，从而降低糖尿病大血管纤维化[12-13]。也有研究表明，桃仁在其他组织器官中抗纤维化的作用，如在肝纤维化的研究中，桃仁煎剂提取物能通过抑制I、III型胶原的沉积，促进肝内已沉积的胶原纤维的降解和吸收，达到预防肝纤维化和逆转肝纤维化的作用[14]。桃仁中主要成分是苦杏仁苷，可有效改善组织纤维病变[15]。因此我们推测，桃仁同样可以阻断糖尿病大血管纤维化，机理可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活，下调血管组织中AKT及p-AKT的表达来实现。本研究得到了初步的验证。

中医角度，中药桃仁具有活血化瘀、润肠通便、止咳平喘等功效，用于周围血管疾病常取其活血化瘀的功效，是临床上活血化瘀剂中的常用药物。周围血管病变的病机常以脉络瘀阻为主，治疗也常常使用活血化瘀剂，配伍理气药如枳壳、香附[16]；配伍其他活血化瘀药如赤芍、红花[16]以加强功效。目前现代药理研究桃仁常以其所含单体为主，但以桃红四物汤、桃核承气汤等为代表的经典方的整体药理研究值得进一步研究。

本研究证实了桃仁对糖尿病大血管纤维化的抑制作用，对临床用药具有一定的指导意义，但是具体机制有待于进一步研究。