蛙温和气单胞菌分离株的药敏试验

曾彦钦 林秋娟 潘 平 陈 震 林福忠 蔡鹤鸣 福州市农业科学研究所 福州 350008

美国青蛙（Rana grylio），俗称牛蛙。蛙温和气单胞菌（Aeromonas sobria）是牛蛙红腿病的主要病原菌。临床上，患蛙表现腹部外观呈浅红色，肝脏充血、出血斑点，肾充血、出血，大量腹水等特征。该病多发生在蝌蚪发育成幼蛙后的2～3周内。发病率可达70%～80%，病死率可达50%～60%，该病发病急，病程短，给蛙场造成很大损失。笔者从漳州3个蛙场分离出18株蛙温和气单胞菌菌株，并对其进行18种抗生素敏感性试验，现将详情报道如下。

1.1.2 细菌生化试验 结果为：（1）37℃能生长、接触酶试验阳性、V-P试验阳性、葡萄糖产酸产气、靛基质试验阳性、甘油试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、半固体培养基刷状或絮状生长、半乳糖产酸、蔗糖产酸、麦芽糖产酸、甘露醇产酸、海藻糖产酸、水解淀粉，明胶试验6℃液化、甲基红试验阳性、脱脂奶溶解试验阳性；（2）硫化氢试验阴性、尿素酶试验阴性、阿拉伯糖发酵阴性、七叶苷发酵阴性、水杨苷发酵阴性、乳糖发酵阴性；（3）赖氨酸脱羧酶试验阳性、鸟氨酸脱羧酶试验阳性、精氨酸双水解酶试验阳性或阴性、果糖产酸阳性或阴性。

选其中4株蛙温和气单胞菌（V-P试验阳性-红色最深、脱脂奶溶解试验阳性-溶解环最宽、果糖产酸-粉红色最深），以其24 h肉汤培养物0.2 mL，颈部皮下注入健康小白鼠（体重15～21 g，每组3只，共15只）。试验小白鼠注射菌液后的第9 h陆续发病，安静、食欲下降、寒战、喘息、耳部变苍白，发病后36～72 h陆续死亡。剖检，见注射局部有大量脓血水，肝肾充血肿大、有出血斑点，肺充血，浅红色腹水。取病死小白鼠心血接种RS培养基，分离出温和气单胞菌菌株。对照组连续饲养观察10 d，小白鼠均存活。

1 材 料

1.1 蛙温和气单胞菌菌株 无菌操作取患蛙肝、肾组织，接种RS培养基平皿，30℃培养24 h；选光滑圆整、半透明、微隆起、浅桔黄色、直径0.8～1.2 mm的菌落，以氧化酶试纸检测所选菌落；挑氧化酶试验阳性菌落，穿刺AHM试管斜面；选AHM试管斜面呈上层红色、下层黄色、毛絮状生长、有气泡、无黑色物的培养物，进行革兰氏染色镜检和细菌生化鉴定。

1.1.1 镜检 12.5×100倍油镜下呈革兰氏阴性短小杆菌。

1.2 药敏纸 由Oxoid ltd.Basingstoke(Hampshire Englang)生产，批号2018-03。

1.3 培养基、试剂 AHM培养基、RS培养基、营养琼脂、营养肉汤、脱脂奶蔗糖营养琼脂、各种细菌生化鉴定管和鉴定试剂，由青岛海博生物技术有限公司生产。

1.4 试验动物 小白鼠由福建省疾病预防控制中心医学实验动物研究所提供。

2 方 法

先将18株蛙温和气单胞菌菌株分别接种于AHM试管斜面，培养24 h。分别以接种环钓取各株菌落混于无菌生理盐水中，再以无菌棉签蘸取菌液，均匀涂抹于普通营养琼脂平板（每菌株需4个平板），涂满不留空隙。再以镊子夹取药敏纸片贴在待测菌的琼脂平板上，并用镊子轻压纸片。注意无菌操作和编号。培养24 h，测量抑菌圈直径。

3 结 果

测量抑菌圈直径平均值，结果：庆大霉素（20.4 mm）、氟苯尼考（19.2 mm）为相对高效药物；中效药物从高到低依次为阿米卡星（18.1 mm）、蒽诺沙星 （17.5 mm）、新 霉 素 （17.5 mm）、氧 氟 沙 星（16.4 mm）、 环 丙 沙 星 （14.1 mm）、 诺 氟 沙 星（13.4 mm）；低效药物有红霉素（11.8 mm）、强力霉素（11.5 mm）、多粘菌素 （8.6 mm）。复方新诺明（0 mm）、四环素（4 mm）、阿莫西林（0 mm）、氨卞西林（0 mm）、头孢噻吩（2.8 mm）、杆菌肽（0 mm）、链霉素（0 mm）为无效药物。

4 讨论与小结

1）参照《伯杰氏系统细菌学手册》第二版中的气单胞菌属（Aeromonas）内容和GB/T 18652-2002《致病性嗜水气单胞菌检验方法》，对分离菌进行鉴定，确定分离菌为温和气单胞菌[1]。

2）仔细分析表1结果发现，从同一牛蛙场分离出的温和气单胞菌不同菌株，其药敏试验结果存在较大的差异。例如，来源于A蛙场的蛙5-2株和胃3株，前者对庆大霉素和红霉素敏感，后者却无效；来源于B蛙场的B2-2株对喹诺酮类药不敏感，但对红霉素敏感，B3-2株却相反；来源于C蛙场的Q1-22株和Q3-21株，也不同于C场的其他温和气单胞菌株。

试验结果表明，蛙温和气单胞菌对抗生素的耐药性是严重的，说明该地区或很可能不仅限于该地区，牛蛙场滥用抗生素的现象比较普遍。由于温和气单胞菌也能致其他水产生物发病，这些耐药性菌株也可能来源于其他水产生物养殖场。

3）牛蛙养殖密度很高，一定要有充足的洁净水源（最好是深井水或水库源头水），不可用别的水产生物养殖场废弃水。蛙温和气单胞菌病的防疫应从水源、引种、隔离入手，该抗生素敏感性试验结果可作为该地区牛蛙场参考；结合牛蛙场的养殖特点，需选用易溶于水的药物混合饲料；用药时须注意无公害的问题。

表1 18种抗生素对18株蛙温和气单胞菌菌株的抑菌圈直径