急性氧化应激初期人晶状体上皮细胞株SRA01/04中衰老标记蛋白30抗氧化作用的研究△

韩子豪 李松蔓 李艳玮 陈曦 张鸿侃 蒋林志 梁皓

研究表明，人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell，HLEC)凋亡是所有非先天性白内障形成的共同细胞学基础[1-2]，而氧化应激被认为是使细胞发生凋亡的重要因素之一[3-4]。衰老标记蛋白30(senescence marker protein 30，SMP30)作为近年来的研究热点，国内外研究多聚集于其在肝肾方面的抗氧化和抗凋亡能力，而本课题组在前期研究中已证实，HLEC中SMP30表达量减少，是引起白内障的原因之一[5-6]，同时发现急性氧化应激使HLEC株SRA01/04中SMP30表达上调，提示SMP30参与晶状体上皮细胞的氧化应激损伤过程[7]，故我们猜想，如果增加了SMP30的表达，是否在氧化应激反应的早期即可发挥并加强其抗氧化能力呢？因此，本研究拟通过改变HLEC株SRA01/04细胞内SMP30含量，观察各组细胞在急性氧化应激初期时细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力及氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)/总谷胱甘肽(total glutathione,T-GSH)比值的变化，初步探讨当SRA01/04处于急性氧化应激初期时，SMP30对SRA01/04的保护作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器HLEC株SRA01/04(广州吉妮欧生物科技公司)；1640 L-Glutamine培养基、2.5 g·L-1Trypsin胰蛋白酶、胎牛血清(10099-141)(美国Gibco公司)；CCK-8(日本 Dojindo)；青霉素、链霉素(美国Amresco公司)；RGN慢病毒载体(上海吉凯基因公司)；Trizol试剂盒(上海普飞公司)；实时定量PCR仪器(Roche，瑞士)；GSSG/T-GSH测定试剂盒、SOD测定试剂盒(WST-1 法)(南京建成生物公司)。细胞培养超净工作台(苏净安泰公司)、CO2培养箱(美国Thermo公司)、光学显微镜(日本Olympus公司)、高速离心机(德国Eppendorf公司)、酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养使用含体积分数10%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素及100 mg·L-1链霉素(pH 7.4)的1640培养基培养SRA01/04细胞，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱内培养，作为正常对照(control，CON)组细胞。

1.2.2SRA01/04急性氧化应激模型最佳H2O2浓度选择选取处于对数生长期的SRA01/04，加入胰蛋白酶消化后重悬，细胞计数。随后按20×106个·L-1接种入96孔板中，每孔100 μL，每组设3个复孔，于37 ℃、含体积分数5% CO2的细胞培养箱内培养12 h后，除一组继续用正常培养基培养外，其余组分别加入含150 μmol·L-1、200 μmol·L-1、250 μmol·L-1、300 μmol·L-1、350 μmol·L-1、400 μmol·L-1、450 μmol·L-1H2O2的培养基作用2 h(H2O2浓度设置参考文献[8-9])，之后将所有培养基更换为正常培养基，并每孔加入10 μL CCK8，37 ℃ 避光2 h后酶标仪测定各孔在450 nm的吸光度值(A)值，实验重复3次。计算细胞抑制率，即：细胞抑制率=(1-OD实验组-调零组/OD阴性对照组-调零组)×100%。以细胞抑制率为50%时H2O2浓度值建立处于急性氧化应激初期的细胞模型。

1.2.3慢病毒转染细胞根据课题组前期研究，利用载体对细胞进行转染(具体步骤参考文献[10])，得到SMP30过表达(over expression，OE)组以及其相应的空载(negative control over expression，NCOE)组细胞，荧光显微镜下观察细胞状态。

1.2.4SRA01/04急性氧化应激模型的建立CON组、OE组、NCOE组细胞均用含体积分数10%胎牛血清的1640培养基培养，待细胞生长达70%～80%融合时加入含300 μmol·L-1H2O2的培养基继续培养2 h，得到处于急性氧化应激初期时的CON组、OE组和NCOE组细胞。

1.2.5定量检测试剂盒检测细胞内SOD、GSH含量使用SOD测定试剂盒(WST-1法)及GSSG/T-GSH测定试剂盒测定CON组、OE组和NCOE组细胞中SOD活力和GSSG/T-GSH比值。测定前通过细胞计数确认细胞密度≥109个·L-1，之后用胰蛋白酶消化，最后严格根据测定试剂盒说明操作，利用酶标仪在450 nm波长处读取数据，通过计算得出SOD活力值及GSSG/T-GSH比值。实验重复3次。

2 结果

2.1不同浓度H2O2处理后细胞抑制率比较不同浓度H2O2处理HLEC 2 h后，细胞抑制率随H2O2浓度的增加呈升高趋势。H2O2浓度为150 μmol·L-1、200 μmol·L-1、250 μmol·L-1、300 μmol·L-1、350 μmol·L-1、400 μmol·L-1、450 μmol·L-1时其细胞抑制率分别为15.6%、34.3%、42.4%、46.5%、70.0%、79.4%和85.1%，确定后续实验选取300 μmol·L-1H2O2作为半数致死量处理HLEC，在此浓度下细胞存活率最接近于50%。

2.2各组SOD活力通过对酶标仪测出结果进行统计分析显示，相比CON组(5.783±0.192)U·mg-1及NCOE组(5.837±0.182)U·mg-1，OE组细胞内SOD活力明显升高，为(10.251±0.110)U·mg-1，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.3各组GSSG/T-GSH比值通过对酶标仪测出结果进行统计分析显示，相比CON组(29.943±0.241)及NCOE组(30.037±0.433)，OE组细胞内GSSG/T-GSH比值(20.990±0.342)明显降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

3 讨论

白内障是全球范围内中老年人致盲的主要原因之一[11]，也是中国中老年人群致盲的首要原因，如何对其进行防治已成为人们关注的焦点。研究表明，白内障的发生发展是多种因素相互作用的结果，其中，由于晶状体受到氧化应激损伤而导致HLEC代谢出现障碍进而凋亡是年龄相关性白内障发生的最重要因素之一[2，12]，当HLEC遭遇氧化应激损伤时，由于氧化-抗氧化系统失衡，会使大量氧自由基堆积，而过量堆积的氧自由基会通过各种作用损伤细胞，使其发生凋亡，最终导致白内障的发生[13]。近期研究发现，抑制HLEC中的氧化应激可有效阻止细胞的凋亡，从而达到预防和延迟白内障形成的目的[14-16]。因此，如何调节细胞内的氧化反应，维持细胞内环境稳定，从而保护HLEC免受氧化应激损伤诱导的细胞凋亡，是本实验的重点。

SMP30最初是由日本学者发现的新型抗衰老因子[17]，有着抗氧化、抗凋亡、抗衰老、参与脂质调节、抗肿瘤以及维持钙稳态等作用[18]，国内外研究者多致力于研究其在肝肾疾病方面的作用[19-20]，而近年来的研究表明，SMP30与氧化应激诱导的HLEC损伤密切相关[10，21-22]。此外也有报道证实，与普通型小鼠相比，SMP30基因敲除组小鼠更易患白内障[23]。本课题组前期对白内障患者的研究也表明，由于年龄增加导致的SMP30含量减少有可能是导致白内障发生发展的一个重要原因[5]。之后我们证实，在H2O2诱导的急性氧化应激情况下HLEC中SMP30表达上调，提示其参与了HLEC的氧化应激损伤过程[7]。据此，我们推测，当SRA01/04处于H2O2诱导的急性氧化应激状态时，SMP30的增加可发挥重要的抗氧化作用，对细胞进行保护，从而避免其进一步损伤。故本研究拟通过建立SRA01/04急性氧化应激模型并调控SMP30含量、检测细胞内SOD活性及GSSG/T-GSH比值变化而对此问题进行初步探讨。

SOD与GSH是细胞内的氧自由基清除剂及抗氧化剂，可通过清除细胞内的氧自由基来降低细胞内的氧化应激反应而发挥重要的抗氧化作用，测定SOD活性与GSSG/T-GSH比值变化情况可一定程度反映细胞内氧化应激水平的变化[24-25]。本研究发现，与正常细胞相比，SMP30高表达组细胞内的SOD活力增高且GSSG/T-GSH比值降低，提示在SRA01/04处于急性氧化应激初期时，高表达的SMP30即可通过调控细胞内SOD活性与GSSG/T-GSH比值而增强细胞的抗氧化能力，这或许能在一定程度上阻止活性氧自由基对细胞损伤后导致的细胞凋亡，最终延缓白内障的发生。

综上所述，本研究认为，当SRA01/04处于急性氧化应激初期时，SMP30可通过调控细胞中SOD活性与GSSG/T-GSH比值的变化而在一定程度上维持SRA01/04中内环境的稳定，减弱由H2O2诱导的细胞内的氧化损伤，且此抗氧化作用可能随着SMP30含量的增加而增强。但是，SMP30具体通过何种机制调控HLEC内的氧化反应对晶状体细胞进行保护仍需进一步研究。未来，我们拟通过进一步实验调控细胞和动物体内SMP30的表达量，进一步观察其对HLEC内氧化应激、钙紊乱、凋亡等方面的调控作用，为白内障的病因研究和预防机制奠定基础。