草酸钙晶体在乳腺内形成机制的研究进展

俞柯杰，蔡振刚

(大连医科大学附属第一医院乳腺外科，辽宁 大连116023)

乳腺癌是目前威胁女性健康的主要疾病之一，虽然乳腺癌的发病率呈上升趋势，但死亡率呈现下降趋势，这得益于乳腺癌的早期发现和综合性治疗。乳腺钼靶是筛查早期乳腺癌的主要方法，其中30%～50%的非触及型乳腺癌是通过乳腺钼靶中出现微钙化而发现的。Frappart等[1]提出矿化物的分类，乳腺内的微钙化从化学组成成分上主要分为两种类型：Ⅰ型以草酸钙为主，Ⅱ型以羟基磷酸钙为主。Ⅰ型见于良性乳腺病变及部分小叶原位癌；Ⅱ型见于乳腺癌及部分良性疾病，良性疾病的矿化物中可含有少量的蛋白类物质及碳酸钙[2]，并且矿化物中碳酸钙含量越多，乳腺病灶的恶性程度越低[3]。近年来研究发现，在乳腺癌矿化物中可以检测到羟基磷酸镁，但在良性病变中未观察到[4]。在乳腺癌的矿化灶中铜元素较良性病变高，而锰元素降低。在结晶程度和形态上，草酸钙结晶程度好，可以形成多面体状晶体，而羟基磷酸钙则结晶度较差，形成晶体细小，甚至呈无定形态[5]。虽然良恶性乳腺病变的微钙化在组成成分上不同，但在临床工作中主要是通过乳腺钼靶进行观察，这类病例在乳腺影像报告和数据系统分级上多属于4类，如何进一步鉴别良恶性是困扰临床医师的难题。现就草酸钙的特点及相关形成机制进行综述，为进一步探讨乳腺中的草酸钙矿化形成提供相关线索，为深入研究鉴别乳腺疾病良恶性微钙化提供新思路。

1 乳腺内草酸钙的病理特点

在研究乳腺中草酸钙的形成机制前首先要了解草酸钙形成时的病理特点，如草酸钙在乳腺内的形态、分布位置、周围组织的病理改变等，这对形成机制的研究具有重要意义。草酸钙在常规染色切片中缺乏亲和力，着色不显著，很容易被忽视，而在偏振光显微镜下草酸钙晶体具有双折光性[6]。目前研究认为草酸钙主要见于良性疾病，乳腺内能形成矿化物的良性疾病主要有乳腺纤维腺瘤、乳腺内脂肪坏死和乳腺增生症，其中乳腺增生症的钙化与乳腺癌内钙化在影像学上最容易混淆[7]。①乳腺增生症的矿化病理表现为矿化物位于管腔内，呈砂粒体样或鲕状，直径5～100 μm。矿化颗粒较小时位于腺上皮细胞与基膜之间。矿化颗粒体积较大时，其发生在腺腔或腺上皮与上皮基膜之间，颗粒中央染色常呈均质浅染状，腺上皮细胞常可见顶端的胞质突起。增生症的矿化物中存在Ⅳ型胶原，未检出Ⅲ型胶原。②乳腺纤维腺瘤的矿化常见病理表现为大片状无定型矿化，常伴有陈旧性坏死改变，在坏死的周边也可观察到沿间质胶原分布的泥沙样矿化，其矿化物中基本存在Ⅲ型胶原，而Ⅳ型胶原仅在腺腔内砂粒体样矿化周围可见。③乳腺脂肪坏死的矿化病理表现为粗细不一的无定形的泥沙样状，直径1～50 μm，缺乏明显的同心圆状结构。免疫组织化学法可以检出Ⅲ型胶原，但未见Ⅳ型胶原[8]。

2 乳腺中草酸钙的形成机制

草酸钙由草酸根离子与钙离子结合形成，是各类结石以及钙化的主要成分。草酸钙在肾结石中的研究较为深入，但乳腺中草酸钙的形成机制目前尚不明确，相关研究较少。

2.1草酸盐的来源 外源性草酸的来源是经肠道吸收富含草酸的食物，如菠菜、大黄、苋菜、甜菜、花生、马齿苋、芋头、甘薯、巧克力等[9]。乳腺中的草酸成分主要为内源性草酸，内源性草酸前体物质为乙醛酸、抗坏血酸、羟脯氨酸、甘氨酸等。其中乙醛酸是草酸的主要前体，其通过酶解形成草酸，主要的酶有乙醛酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶和乳酸脱氢酶，其中以乳酸脱氢酶的作用为主。抗坏血酸来源的草酸盐占30%～50%，摄入抗坏血酸可提高内源性草酸水平，是结石的危险因素之一[10]。抗坏血酸先转化为L-抗坏血酸，最终分解成草酸和苏糖酸，这是一个自发缓慢的降解过程。目前认为氧化应激可促进组织内草酸盐的生成及代谢，从而造成草酸在组织内的沉积[11]。除此之外，正常人体的胃肠道细胞更新较快，大量细胞内RNA分解出尿嘧啶被吸收，经过与多聚磷酸结合，环裂解形成草酸、氨基甲酸及尿素等[12]。草酸盐是一种有机二元羧基阴离子，体内存在形式包括溶解形式的草酸钠、草酸钾或不溶解的草酸钙。草酸盐是体内代谢活动的最终产物，人体不能继续分解草酸盐。草酸盐在细胞内聚集具有细胞毒性作用，草酸钙的形成是人体排除有害物质的表现。

2.2草酸钙的合成部位 目前对草酸钙晶体的形成机制尚不清楚，但它们的合成必然与草酸根离子和钙离子在体内特定区域大量积累有关。细胞内质网是钙离子的主要储存场所，在维持钙离子稳态方面发挥重要作用，从而推测合成草酸钙的位置在内质网。有研究表明，内质网的不稳定导致钙离子的内稳态失衡，造成钙离子在内质网中逐渐累积，进一步促进疾病的形成，而草酸盐可增加内源性内质网应激标志物葡萄糖调节蛋白及C/EBP同源蛋白的表达，在诱导内质网应激方面起关键作用[13]。肿瘤细胞中的葡萄糖调节蛋白增加可激活促肿瘤信号，加快肿瘤进展[14]，故内质网因细胞内钙离子稳态失衡可引起内质网氧化应激，进一步促进细胞凋亡[15]，而内质网应激在肿瘤的发生、发展、转移中均发挥重要作用，包括乳腺癌[16]。结上所述，草酸盐诱导内质网应激，促使内质网中钙离子聚集，进一步形成草酸钙结晶，故可初步推测草酸钙的合成部位与细胞内质网相关，且与肿瘤的形成有一定关联。

2.3钙离子转运 钙离子作为细胞信号转导通路中重要的第二信使，可参与并调节细胞迁移，有证据表明提高钙离子的浓度可促进肿瘤细胞的转移[17]。乳腺中的钙离子转运是整体单向转运，钙离子跨膜转运的过程必须具备大容量、单向和诱导特性的通道，而钙离子通道可发挥这一作用，其中一类通道为瞬时受体电位阳离子通道，在维持乳腺钙离子稳态上及转运中起重要作用。然而钙离子作为细胞内的信使并不能直接发挥作用，需要钙离子缓冲区及钙离子调节蛋白来翻译其信号。在内质网腔中存在钙网蛋白，其是主要的钙离子结合蛋白，可增加钙离子的累积能力，并有分子伴侣作用，可确保蛋白质正确合成、折叠[18]。内质网可吸收大量细胞质的钙离子，且钙网蛋白加强了内质网腔对钙离子的缓冲能力，胞内钙离子浓度的增加为草酸钙晶体的形成提供了充足的钙源，而钙浓度的变化对草酸钙晶体的形态及水化状态均具有影响[19]。在伴有微钙化的乳腺细胞中，许多钙离子通道增加，如瞬时受体电位阳离子通道和相关蛋白附件A2、A4和A5的数量较非肿瘤细胞明显增多。这些蛋白通道及附件可以增加细胞内钙离子的浓度。同时也有证据显示，瞬时受体电位阳离子通道7在伴有微钙化的乳腺细胞中表达增加，可促进细胞增殖、迁移和转移[20]。目前钙离子通道也是乳腺癌潜在的药物靶点。

2.4草酸根转运 植物细胞内草酸根的前体是抗坏血酸,将抗坏血酸转化成草酸是在细胞的质体上进行加工转化[21-22]。形成的草酸在液泡中与钙离子相结合，通过液泡中的小室及基质调控晶体的成核及生长[23]。动物体内草酸的前体物质主要为乙酸醛、抗坏血酸、羟脯氨酸、甘氨酸等，这些物质都要经过复杂的代谢途径产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和副产品草酸，草酸根的合成部位与线粒体关系密切。草酸进入细胞是通过跨膜转运，主要通过SLC26家族的转运蛋白进行[24]。SCL26是阴离子转运蛋白，SLC26基因家族可以在各种组织中表达，编码多种阴离子交换剂和阴离子通道。目前发现SCL26有11个成员，但SLC26A10可能是一个假基因。与草酸转运有关的成员包括SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A6、SLC26A7和SLC26A9，转运方式包括草酸根离子/氯离子交换、氯离子/碳酸氢根离子交换、硫酸根离子/草酸根离子交换[25-26]。

2.5草酸钙的囊泡转运 草酸钙在乳腺上皮细胞内合成后以主动分泌的形式释放到细胞外基质。乳腺内的分泌细胞起源于末端导管-小叶单位。在病理切片中可观察到分泌腺化生细胞存在顶端分泌突起，并在细胞内也观察到囊泡[27]。囊泡转运是细胞中物质和信息交流的主要方式，囊泡的分泌过程包括出芽、转运、靶向、拴系、锚定、启动、融合和胞吐。囊泡出芽是由包被蛋白介导的，包被蛋白是一种动态结构，由小GTP蛋白家族中的Arf1/Sar1蛋白从胞质募集结合到膜上又从膜上脱落。转运是从产生点向分泌区的移动，一般是在马达蛋白的牵引下沿细胞骨架(微丝/微管)向分泌活动区运输。靶向是在 exocyst-sec6/8复合体介导下与细胞骨架相互作用。拴系是在小GTP蛋白家族中的Rab蛋白与可溶性因子Vsolp/p115共同作用下促进囊泡与胞膜的可逆性黏合。锚定通过可溶性的N-乙基马来酰亚胺敏感因子连接物复合体在囊泡膜和细胞膜间形成稳定的三分子结构。其一是小突触泡蛋白和突触融合蛋白组成，另两个是由突触小体相关蛋白SNAP-25组成。复合体形成“亮氨酸拉链样”的嵌入式结构，并延伸进入胞膜脂质双层，参与囊泡膜融合体的形成。囊泡转运中的膜融合过程都是由可溶性的N-乙基马来酰亚胺敏感因子连接物复合体介导，融合指脂双层的融合，包括两步：首先脂双层克服脂质分子头部间水合力的作用被拉近，然后脂双层的亲水部分和疏水部分间边界的去稳定，最终融合孔打开和快速扩展[28-30]。囊泡内的草酸钙排出细胞进入管腔或细胞基质间隙。

2.6草酸钙的矿化 乳腺内草酸钙晶体在细胞外聚集增大的机制目前较少见报道。作为草酸钙晶体最常见的部位是肾结石，其次是各种肿瘤内的钙化灶，如甲状腺乳头状癌、胃癌、脑膜瘤、卵巢浆液性乳头状癌等[31]。现阶段研究最为深入的是肾结石的形成，了解肾结石中草酸钙的相关形成机制可以为乳腺内草酸钙钙化灶的形成提供思路。肾结石形成理论主要包括以下几种。①上皮细胞损伤：在草酸盐的诱导下细胞膜的酸性磷脂酰丝氨酸通过外翻和侧向运动可在特定区域聚集，吸引钙离子与草酸根离子相互作用，导致草酸钙晶体成核。此外，损伤的细胞表面表达α3整合素、白细胞分化抗原分化群44、透明质酸等，这些因子均与草酸钙有极强的亲和能力，促进草酸钙晶体生长。②Randall斑学说在上皮损伤发生时骨桥蛋白表达增强，后者能够募集周围巨噬细胞吞噬羟基磷灰石晶体，转运到细胞基膜，以羟基磷灰石为成核点，草酸钙聚集结晶。目前研究认为最先形成的羟基磷灰石晶体与钙化性纳米微粒有关，在乳腺钙化灶的研究中也发现钙化纳米微粒的存在[32]。③晶体抑制物缺乏学说:体内骨桥蛋白、基质Gla蛋白、胎球蛋白A是重要的抑制钙化因子，其缺乏时草酸钙容易成核[32-33]。另外，虽然草酸钙形成的矿化灶多存在于乳腺良性病变，但部分乳腺小叶癌钙化中也存在草酸钙。了解乳腺癌中微钙化的矿化机制，亦可对草酸钙矿化灶的形成提供线索。目前认为[3-4]乳腺癌细胞经过上皮-间充质化并且获得成骨细胞特征，在骨形态发生蛋白的参与下转化为成骨样细胞，并且表达微钙化相关蛋白。随后载有微钙化相关蛋白的脂筏从细胞膜脱落，形成基质囊泡并进入细胞。该基质囊泡的pH值不同于细胞质的pH值。因此，在适当的pH下单晶体形成，然后基质囊泡被释放到细胞外基质中。在细胞外基质中单晶体起着核的作用，细胞外液含有的钙离子继续以此为成核点聚合，晶体逐步生长增大，从而形成矿化灶。此外，在炎症因子CC趋化因子配体2、CC趋化因子配体5和集落刺激因子1的作用下，募集大量肿瘤相关巨噬细胞到微钙化周围，这些巨噬细胞通过分泌基质囊泡到晶体的成核位点，从而进一步传播这一过程[34-35]。目前一些研究结果支持草酸钙的形成可能与细胞主动分泌的产物相关，而磷酸钙的形成可能是与骨生理矿化过程类似的主动过程，而不是与细胞退化相关的被动的终末期过程[27，36]。此外，研究还发现部分上皮细胞具有间充质特性，能产生乳腺草酸钙微钙化[3-4，36]。在乳腺中，顶浆分泌细胞起源于末梢导管小叶单位，顶浆分泌口通常存在于顶浆上皮化生细胞，胞质内可见液泡。管腔内草酸钙晶体偶见与顶浆上皮化生有关，尤其是在扩张的导管中[37-38]。

3 草酸钙与乳腺癌的关系

以往一般认为乳腺中的草酸钙钙化灶只存在于乳腺良性病变，如乳腺囊肿、积乳及增生病变[37]。在恶性病变中草酸钙仅限于预后良好的小叶原位癌，因此乳腺疾病中草酸钙矿化的研究未得到重视。但有研究表明，草酸钙晶体既与浸润性癌有关，也与原位癌有关[39]。有病理学研究发现[27]，乳腺癌组织中草酸含量高于非癌性乳腺组织；免疫组织化学结果显示，在乳腺切片中，癌组织表达的c-Fos 基因含量明显高于非癌性乳腺组织。c-Fos基因可调控细胞的生长及凋亡，乳腺细胞长期接触草酸盐，通过促进c-Fos基因过度表达和细胞增殖能使正常细胞向癌细胞或肉瘤转化，并且草酸盐促进c-Fos基因过表达的这种作用只在乳腺细胞中存在，在其他含草酸钙的细胞中并未发现c-Fos基因过表达。该研究也首次证明草酸盐具有促进乳腺细胞增殖的作用，并且浓度越高，形成肿瘤的速度越快。在乳腺增生伴有钙化的导管上皮也存在汗腺化生，异型汗腺化生有发展成乳腺癌的危险性，这应引起临床医师的注意[40-41]。目前研究认为，羟基磷酸钙可以促进乳腺癌细胞迁移，而草酸钙并不能增加乳腺癌细胞的迁移能力[3]。

总之，目前草酸钙与乳腺癌关系的相关研究较少，并没有直接证据证明草酸钙与乳腺癌的发生、发展有密切关系，各个研究的结果也并不一致。以往大部分研究倾向于草酸钙与乳腺良性疾病相关，与乳腺癌的形成及转移无相关性，但近年来有部分研究表明草酸钙与乳腺癌之间存在某种关联，可能与乳腺癌的发生相关[27，40-41]。在上述草酸与钙离子方面的研究中，草酸浓度的增加会促进内质网的氧化应激反应，从而进一步加快肿瘤的发展及细胞凋亡；而乳腺细胞中钙离子的内稳态失衡导致钙通道蛋白增加，钙离子浓度增高，可促进肿瘤细胞的增殖及迁移。草酸及钙离子浓度的上调均会增加乳腺癌发生的可能性，推测乳腺中草酸和钙离子形成的草酸钙晶体也可能与早期乳腺癌的发生相关，但这一推论有待进一步研究证实。

4 小 结

乳腺中草酸钙的形成常被人们忽视。上述通过研究钙离子、草酸根的转运，以及借鉴肾结石中草酸钙和乳腺癌中羟基磷酸钙的形成机制为乳腺中草酸钙的形成机制提供了一些线索。目前认为乳腺中草酸钙的形成与顶浆上皮细胞化生有关。顶浆上皮细胞起源于乳腺末梢导管小叶单位，通过一系列钙离子、草酸根离子的结合及转运，主动分泌草酸钙晶体，该晶体多存在于扩张导管中。这一观点仍有待进一步实验研究证实。乳腺肿瘤细胞中草酸盐的含量明显高于正常细胞，推测草酸钙对乳腺癌的发生可能也有一定的相关性，因此研究乳腺中草酸钙的形成可能有利于鉴别良恶性微钙化，早期诊断乳腺癌。