Toll样受体4与肺纤维化相关的研究进展

李 婷，邓树豪，董昭兴

(昆明医科大学第二附属医院呼吸与危重症一病区，昆明 650101)

肺纤维化是一种由各种原因引起肺泡持续性损伤、细胞外基质过度沉积、成纤维细胞对肺部受损调节不受控制，从而导致肺部纤维化、正常肺组织结构改变及功能丧失，多数患者在终末期因呼吸衰竭而死亡的疾病[1]。随着人口老龄化加剧，肺纤维化的发病率不断上升，已成为一个严重的社会健康问题[2]。近年来，虽然肺纤维化治疗方面的研究取得了一定进展，但多数患者的平均预期寿命仅2～4年[3]。因此，寻找肺纤维化的新治疗靶点显得十分重要。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是先天性免疫系统中的细胞跨膜受体和病原膜识别受体之一，其通过识别外来的微生物和入侵的病原体，发出内源性危险信号并激活机体产生免疫应答。而TLR4作为一种膜识别受体，通过与相应配体的结合能激活机体固有免疫反应，在细胞的信号转导、自噬的发生、炎症反应的调节等方面有重要作用[4]。其中，持续存在的炎症反应导致的各细胞因子异常分泌是肺纤维化发生的重要病理基础。现就TLR4与肺纤维化相关的研究进展予以综述。

1 TLR4的主要结构及其信号通路

机体的免疫系统是一种非常复杂的宿主系统，它在机体的生命历程中不断进化，以应对内外环境中各种病原体对机体的入侵。先天性免疫系统包含多种免疫细胞，其胞膜表面提供了可识别特定病原体相关分子模式，从而建立特定免疫保护反应的多种膜受体，TLR是其中之一。自1997年末人类首次发现TLR4以来，已在哺乳动物中发现并描述了13种不同类型的TLR[5-6]。TLR的实质是一种跨膜蛋白质，TLR4作为一种跨膜识别受体，其结构主要包括三部分：富含亮氨酸的胞外段、跨膜段及含有Toll/白细胞介素(interleukin，IL)1受体(Toll/IL-1 receptor，TIR)结构域的胞内段。在胞外段，富含亮氨酸的TLR细胞外域限定了TLR4与特定配体的结合[7]。而髓样分化蛋白(myeloid differential protein,MyD)2与TLR4相互作用后，在脂多糖结合蛋白、白细胞分化抗原14等辅助分子的参与下，可诱导配体与TLR4胞外段上的MyD2分子结合，形成TLR4-MyD2二聚体与配体的结合物。结合物产生的聚合信号可进一步转导至胞内段的TIR结构域，TIR结构域为一段与IL-1具有高度同源性的区域，是TLR4信号转导途径的核心元件，从而引发下游适配器蛋白的招募[8]。适配器蛋白主要包括MyD88、MyD88相关接头蛋白、β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adapter inducing interferon-β，TRIF)、TRIF相关接头蛋白4种，这些适配器蛋白与TLR4胞内段TIR结构域相互关联，参与形成两条不同的胞内信号通路。一条为MyD88依赖途径，为TLR4信号转导的主要途径，也是与肺纤维化联系最为密切的途径。该途径通过配体激活的TIR结构域与MyD88及MyD88相关接头蛋白结合，激活下游IL-1受体相关激酶，从而启动下游的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及核转录因子激活蛋白1通路，促进各种炎症细胞因子基因表达的激活；另一条为TRIF依赖途径，其通过TRIF及TRIF相关接头蛋白与配体激活的TIR结构域结合，启动下游信号干扰素调节因子3，从而促进各种炎症反应的发生[9-12]。

2 TLR4信号通路在肺纤维化中的表达及作用

2.1TLR4信号通路在肺纤维化组织中的表达 虽然TLR4及其信号通路参与肺纤维化的发展，但其具体机制尚未明确。有研究通过干预TLR4的表达指出，TLR4的表达与肺纤维化的发展有密切联系。在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化组织中，TLR4表达阳性的细胞浸润明显增强；通过流式细胞术分析TLR4及其下游的适配器蛋白MyD88、TRIF等发现，TLR4信号通路相关蛋白的表达明显上调，提示在纤维化小鼠的肺组织中TLR4信号通路被广泛激活[13]。与正常小鼠相比，TLR4基因敲除小鼠肺组织胶原的表达明显减少，同时死亡率及纤维化程度也降低，提示TLR4的表达有助于肺纤维化的发展[14]。在关于肺纤维化的细胞实验中发现，脂多糖通过激活TLR4信号的表达，诱导人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因下调和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路激活，促进肺成纤维细胞的增殖，这可能在急性肺损伤后的早期加速肺纤维化的发展，而运用TLR4干扰小RNA沉默肺成纤维细胞的TLR4基因后，脂多糖促进肺成纤维细胞增殖和转化的作用减轻[15]。在联合敲除小鼠TLR4及TLR2基因的实验中发现，联合基因敲除的小鼠在辐射诱导后TLR表达的缺失使肺纤维化程度加重，故认为TLR4或TLR2中的一个或两者共同在肺纤维化发展过程中具有保护作用[16]。同时与正常小鼠相比，TLR4基因敲除的小鼠在经博来霉素诱导后肺纤维化程度加重，可见TLR4的缺失影响了组织的炎症反应及持续免疫抑制的缓解，促进了肺组织损伤后组织纤维化的发展[17]。虽然TLR4在肺纤维化组织中表达增加，但基于TLR信号通路的复杂性，干预其表达可能促进肺纤维化发展，也可能抑制肺纤维化发展，其具体机制有待进一步研究[18]。

2.2TLR4信号通路在肺纤维化中的作用 TLR4是TLR受体家族中的一种，其在肺纤维化的发展过程中起关键作用。研究表明，肺纤维化的形成与机体的炎症-免疫反应有密切联系，而TLR广泛表达于各种免疫细胞，如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞等[19]。TLR4信号通路极其复杂，上下游各关键分子除与TLR4存在信号级联传导作用外，还与其他分子蛋白存在交互作用。目前，关于TLR4信号通路与肺纤维化的研究主要集中在其主要配体高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)及下游关键靶蛋白MyD88、NF-κB方面，这些 TLR4信号通路关键分子在肺组织的损伤、修复及纤维化的发展过程中有重要作用。在百草枯诱导的损伤肺组织中，检测到TLR4-MyD88-NF-κB信号通路各蛋白的表达增加[20]。可见，TLR4信号通路各关键蛋白在纤维化肺组织中表达增加，且可能在其发生发展过程中发挥重要作用。

2.2.1激活HMGB1促进肺纤维化发展 HMGB1是一种重要的炎症介质，同时还是TLR4的主要配体。有研究指出，在用HMGB1刺激体外培养的肺成纤维细胞后，其平滑肌肌动蛋白和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达增加并达峰值，且通过NF-κB信号通路介导TGF-β1的释放，可以诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞[21]。脂多糖刺激肺成纤维细胞，可促进纤维细胞的异常增生和胶原蛋白的分泌，从而加剧肺纤维化，并通过诱导HMGB1的激活增强了肺纤维化的发展，其潜在的分子机制与TLR4/NF-κB信号通路的激活及其下游目标有关[22]。此外有研究表明，在百草枯诱发的肺纤维化模型中，其IL-27和IL-23水平显著升高，且支气管肺泡灌洗液中的HMGB1水平也升高，而通过使用甘氨酸或TLR4阴性小鼠来阻断HMGB1信号，可以极大程度地抑制中性粒细胞渗透导致的肺损伤[23]。因此在肺纤维化发展过程中，增强的HMGB1信号，激活了TLR4的级联反应，促进了纤维化的发展。

2.2.2抑制MyD88减轻肺纤维化发展 MyD88是TLR4信号通路上游的主要适配器蛋白，其在肺纤维化中的表达增加，激活后可诱发一系列信号分子的级联反应，参与肺纤维化的发展。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺组织中发现，其MyD88和IL-1受体的蛋白表达增加，而给予氟非尼酮降低IL-1受体和MyD88的表达水平后，可通过抑制炎症小体的产生和MyD88信号通路的表达来减轻博来霉素诱导的肺纤维化[24]。在用人间充质干细胞干预博来霉素诱导的正常小鼠肺组织细胞后，肺组织细胞的炎症和纤维化程度明显减轻，但在MyD88缺失的情况下，人间充质干细胞减轻小鼠肺部炎症和纤维化的能力降低，表明人间充质干细胞干预肺纤维化小鼠所具有的减轻肺部炎症和纤维化的潜力部分是通过抑制MyD88介导的炎症反应而产生[25]。MyD88在肺纤维化组织中表达增加，通过抑制其介导的信号通路可减缓肺纤维化的发展。

2.2.3抑制NF-κB减轻肺纤维化发展 TLR4信号激活可作用于其信号通路下游的NF-κB并促进大量细胞因子的产生，包括促纤维化的IL-1、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等，同时引起各种细胞反应作用于肺组织。有文献报道，在百草枯诱导的小鼠肺损伤中，IL-1、TNF-α、IL-6等促炎细胞因子的表达对急性肺损伤后炎症细胞的激活具有重要意义，沉默相关基因可通过诱导NF-κB炎症通路失活，减轻炎症反应、氧化应激和纤维化，从而延缓肺组织损伤及纤维化的进展[26]。此外有研究指出，运用抗炎分子对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠进行干预，可有效降低肺成纤维细胞的细胞活力和迁移率，抑制肺上皮细胞中与上皮-间充质转化相关的转录因子的表达，减弱博来霉素诱导小鼠的肺纤维化并改善其病理变化[27]。虽然抑制NF-κB介导的炎症信号通路可以减少促纤维化炎症因子的表达，但NF-κB受多种上游信号分子的调节，故TLR4/NF-κB炎症信号通路在肺纤维化中的具体作用仍需进一步研究。

3 TLR4参与肺纤维化的相关机制

3.1调节自噬 自噬失调与各种纤维性疾病的发展密切相关,包括肾脏纤维化、心肌纤维化、肝脏及肺脏的纤维化等。近年来，研究者对导致肺纤维化的潜在机制有了进一步的认识，抑制自噬促进肺纤维化的发展已被初步证实。TLR4可通过作用于B细胞淋巴瘤/白血病-2基因，解除B细胞淋巴瘤/白血病-2对B细胞淋巴瘤/白血病-2同源结构样蛋白抗体1的抑制作用促进自噬，同时还可直接诱导自噬小体的形成[28-29]。有研究从自噬水平阐述了TLR4在博来霉素诱导的肺纤维化组织中的作用，并指出TLR4通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径诱导自噬的发生，从而减轻博来霉素诱导的肺纤维化。TLR4介导的自噬激活对肺组织的损伤、炎症和纤维化转归十分重要。而TLR4的缺乏会干扰炎症的消退，促进损伤肺组织免疫抑制微环境的形成，抑制肺组织的自噬和凋亡，加重肺组织炎症和纤维化。另有研究指出，TLR4的激活在肺纤维化的发展过程中起保护作用[17]。

3.2调节炎症因子 当机体的免疫细胞检测到组织感染或损伤时，机体会产生保护性的炎症反应，对炎症反应的严重程度、持续时间和损伤部位进行严格的控制。免疫炎症保护反应是病原体清除与病原体所在宿主细胞之间的动态平衡，保护损伤组织的关键过程，而肺纤维化的发展正是由于组织发生持续炎症反应，导致组织的修复不受调节和控制产生。TLR4的同源基因已被证实可以调节炎症反应相关基因的表达，通过激活TLR4启动一系列下游靶蛋白，可激活各种转录因子诱导下游IL-1、TNF-α、TGF-β1等细胞因子的产生[10,21]，这些细胞因子在肺纤维化的发展过程中有重要作用。

在静脉注射博来霉素诱导小鼠肺纤维化的实验中，组织学证实在胸膜和胸膜下区域有胶原蛋白沉积，同时肌成纤维细胞转化标志物过表达，这些组织表现与炎症过程有关；在该动物模型中，抑制局部胸膜IL-1β及胱天蛋白酶的表达发现，胶原蛋白沉积减少，故抑制IL-1β表达可能成为治疗肺纤维化的新靶点[30]。此外，IL-1β与严重的进展性肺纤维化有关，表现为肌成纤维细胞、成纤维细胞病灶的形成及大量胶原和纤维连接蛋白的胞外沉积[31]。文献报道，活化的NF-κB增加了TNF-α的形成，而TNF-α 基因启动子本身含有NF-κB位点，即TNF-α能够刺激NF-κB的活化，故两者相互促进。NF-κB通过TNF-α信号通路介导了博来霉素诱导的肺纤维化发展，而抑制NF-κB表达的同时TNF-α表达减少，肺纤维化程度也减轻[32]。在各种细胞因子中，TGF-β1致纤维化的作用已得到证实，其主要通过促进细胞外基质的沉积和成纤维细胞的增殖与转化，以及协同其他各种细胞因子发挥致肺纤维化的作用。另有研究表明，TLR4诱导的NF-κB的激活，促进了TGF-β1的分泌，并通过诱导成纤维细胞的转化和增殖促进肺纤维化的发展[20]。可见，与TLR4信号通路相关的炎症细胞因子均可促进肺纤维化的发生。

4 小 结

作为肺组织重要的膜识别受体，TLR4在肺纤维化的发展过程中有重要作用。目前，有关TLR4及其信号通路对炎症和纤维化影响作用的观点并不一致。基于TLR4复杂的调控机制，TLR4的激活或抑制对不同类型的组织损伤、炎症和纤维化产生的影响也不同。关于TLR4在肾脏和肝脏纤维化等疾病中的作用机制已有较为成熟的研究，而TLR4作用于肺纤维化的具体机制的研究较少。随着研究的不断深入，未来TLR4与肺纤维化之间的关系将更加明确，干预TLR4的表达可能会成为肺纤维化治疗的新靶点。