组蛋白去乙酰化酶抑制剂在脓毒症及急性肺损伤中的作用研究进展

凌 涛，谢 佳，孙大勇※，钱克俭

(1.深圳市龙岗中心医院急诊科，广东 深圳 518116； 2.南昌大学第一附属医院重症医学科，南昌 330006)

脓毒症指感染所致宿主反应失调，进而导致危及生命的器官功能障碍[1-2]。炎症和免疫反应失衡导致微生物生长失控，进而发生致命性炎症反应，出现组织损伤和器官功能障碍。肺是脓毒症最常累及的靶器官，常导致急性肺损伤等肺功能障碍[3]。因此，避免或减轻脓毒症所致急性肺损伤是降低脓毒症死亡率的关键。抗细胞因子治疗脓毒症的基础实验研究中取得了较好的研究结果，但对临床脓毒症患者生存率的影响并不大。最近，重组人活化蛋白C已经从市场撤出，此外，Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)拮抗剂的疗效研究也未能达到第三阶段试验的主要终点。可见，阻断单一炎症介质不足以阻断炎性级联放大反应。目前，脓毒症治疗在抗菌治疗和器官支持治疗方面取得了较大进展，但患者预后仍不佳。据统计，全世界每年脓毒症患病人数超过1 900万，其中有600万患者死亡，病死率超过25%，已成为良性疾病的主要死因之一[4-5]。因此，迫切需要寻找有效的炎症反应上游靶点，以抑制炎症的“瀑布反应”。

组蛋白乙酰化修饰是生理和病理条件下基因表达的重要调节机制之一，对炎症反应和宿主防御反应的影响较大。组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)共同催化调节组蛋白的乙酰化状态，并通过靶向非组蛋白转录调节因子影响基因表达。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)是干扰HDACs功能的一类化合物，通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度调控基因转录，在恶性肿瘤和慢性炎症性疾病等的治疗中发挥治疗作用。在脓毒症及其相关肺损伤中，HDACIs可发挥抑制炎症反应和组织器官保护等多重作用。现就HDACIs在脓毒症及急性肺损伤中的作用研究进展予以综述。

1 组蛋白乙酰化的概述

染色质的基本单位是核小体，由四组核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4构成的八聚体及其周围包裹的147个DNA碱基对组成。核心组蛋白的氨基端尾在核小体突起，并且受到甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等调节和修饰。HATs和HDACs分别对组蛋白的N端氨基酸残基进行乙酰化和去乙酰化调节。HATs将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白尾部，并可中和组蛋白的正电荷，弱化组蛋白与带负电荷DNA的结合，导致染色质结构疏松，有利于基因转录的进行。而HDACs可使组蛋白去乙酰化，促使组蛋白与DNA紧密结合，导致染色质结构致密，从而抑制基因转录。由此可见，核心组蛋白的乙酰化修饰是非常重要的基因表达调控机制。组蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡失调使基因表达调控紊乱，导致肿瘤发生，因此，HDACs成为抗肿瘤药物研究的热门靶点之一。

HDACIs可引起乙酰化核小体组蛋白堆积，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞分化和(或)凋亡。大量临床试验证实，HDACIs具有良好的抗肿瘤作用，且毒副反应轻微。通常将HDACIs分为NAD+依赖性酶和Zn2+依赖性酶两大类，Zn2+依赖性酶包括HDACsⅠ、Ⅱ、Ⅳ亚族；NAD+依赖性酶主要是HDACsⅢ亚族。大多数HDACIs为广谱抑制剂，但是每种HDACI对不同HDAC的抑制活性不同。目前，对Zn2+依赖HDACIs的研究较多，其中曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)是首个被确认的天然来源的特异性HDACI[6]。美国食品药品管理局已批准辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)用于治疗临床晚期和难治性皮肤T细胞淋巴瘤[7]。研究发现，炎症反应相关转录因子、细胞内信号分子、细胞因子受体等均受到乙酰化调节，可见HDACIs可影响炎症性疾病的发生发展[8]。HDACIs作用机制的相关研究为脓毒症的治疗提供了新的路径。

2 HDACIs在脓毒症中的应用

近年来，对HDACIs在肿瘤治疗中作用的研究较多。Leoni等[9]首次对脓毒症中HDACIs作用的研究发现，SAHA可显著降低脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导小鼠外周血单核细胞释放的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-12、α干扰素的水平，并可降低血液中细胞因子的水平。随后，对动物实验模型的研究发现，HDACIs可改善系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化、移植物抗宿主病、哮喘、结肠炎和重症胰腺炎等炎症性疾病的结局[10-11]。Li等[12]对腹腔注射LPS诱导脓毒症休克小鼠的研究发现，SAHA干预1周后，小鼠存活率较对照组(非干预组)显著提高。Zhao等[13]对盲肠结扎穿孔(cecal ligation perforation，CLP)诱导的致命性感染性休克模型小鼠的研究发现，SAHA预处理可明显提高小鼠的存活率，减少“细胞因子风暴”，并减轻远处器官损伤。TSA能显著降低小鼠骨髓巨噬细胞中促炎因子的信使RNA和蛋白质表达水平[14]。在LPS刺激血管内皮细胞后，可上调TLR4及HDAC2的蛋白表达，而TSA干预可下调LPS刺激内皮细胞后的TLR4表达[15]。

HDACIs不仅能抑制脓毒症中过度的炎症反应，还能发挥组织器官保护作用。Zhang等[16]对CLP诱导的脓毒症小鼠模型的研究发现，与未经HDACIs预处理对照组小鼠相比，TSA组和丁酸钠组小鼠肺组织的中性粒细胞浸润减少，细胞间黏附分子-1和E-选择素的表达显著降低，血浆IL-6水平降低，脓毒症所致肺损伤明显减轻，CLP小鼠的存活时间显著延长。在CLP诱导脓毒症小鼠中，TSA能降低肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平，对脓毒症急性肺损伤具有保护作用[17]。Cetinkaya等[18]对新生高氧肺损伤模型大鼠的研究发现，丙戊酸钠治疗可改善肺损伤，减少促炎细胞因子及脂质过氧化生物标志物的表达，增强抗氧化酶活性。使用SAHA立即处理LPS诱导脓毒症小鼠发现，SAHA可逆转LPS诱导的抗氧化酶谷胱甘肽的减少，减轻LPS诱导的肝细胞凋亡，并有效改善脓毒症继发的急性肝损伤[19]。由此可见，HDACIs可抑制过度炎症反应，提高组织细胞存活能力，在脓毒症治疗中可能发挥重要作用。

3 HDACIs在脓毒症治疗中的作用机制

目前认为，HDACIs本质上是固有免疫细胞关键免疫受体表达和抗菌作用的负性调节因子，可降低巨噬细胞对细菌的吞噬和杀伤作用，提高机体对非严重感染的易感性。当机体发生脓毒症和脓毒症休克等严重感染时，HDACIs可保护组织细胞免受致命性的炎症损伤。HDACIs对脓毒症及相关肺损伤的保护作用可能通过以下途径实现。

3.1抑制TLR4-髓样细胞分化因子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)-核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路 TLR4是一种跨膜蛋白，具有识别病原微生物、激活天然免疫系统、介导炎症反应等重要生物学功能。TLR4的结构包括胞外域、跨膜区和胞内域，TLR4胞外域识别LPS后，其构象发生变化，将信号转导至胞内域，TLR4胞内域与MyD88 C端结合，同时MyD88的N端与IL-1受体相关激酶的N端结合，激活IL-1受体相关激酶，通过TNF受体相关因子6和转化生长因子激活激酶1，进而级联激活下游的NF-κB和MAPK信号转导途径。

NF-κB广泛存在于细胞的蛋白质复合物中，具有多向性DNA转录调节作用，可促进细胞因子产生。在静息状态下，NF-κB的两个亚单位p65、p50在细胞质以失活状态存在，当上游信号(通常为MyD88介导的TLR4/NF-κB信号通路)激活后，使p65、p50活化，转移到细胞核内，以p65亚单位为著，并与相应炎症基因结合。与炎症反应关系较密切的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎症介质的基因启动子上均有NF-κB的结合位点，NF-κB与其结合后，可增强基因的转录和表达，促使炎症介质大量释放，从而导致组织细胞的炎性损伤。与非转基因技术构建的胰腺炎模型小鼠相比，雨蛙素诱导的转基因技术增强NF-κB表达急性胰腺炎小鼠模型的NF-κB激活水平升高，且IL-1β、IL-6、TNF-α的表达明显上调，胰腺炎加重[20]。将高选择性HDAC6抑制剂Tubastatin应用于LPS刺激的原代乳腺上皮细胞后，TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子的释放显著降低，可能与HDAC6抑制导致NF-κB信号转导途径抑制有关[21]。在NF-κB转录活性的调控中，p65的乙酰化起到关键作用，p65的乙酰化可降低p65与DNA的结合，并促进其移出细胞核，从而抑制NF-κB活性[22]。

MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可将信号从细胞外转导到细胞核内部，并可介导细胞的生长、发育、分裂、炎症反应及其对环境的应激适应等多种细胞生理过程。MAPKs家族包括胞外信号调节激酶、c-Jun氨基端激酶、p38激酶等亚族，LPS可激活以上多条通路，使效应细胞分泌炎症因子。研究发现，p38 MAPK抑制剂可降低急性胰腺炎动物模型肺组织的中性粒细胞趋化因子和髓过氧化物酶的水平，减轻肺组织病理损伤[23]。Kim等[24]发现，HDACIs可提高CLP诱导脓毒症小鼠的存活率，减轻器官损伤，并降低血清TNF-α和IL-6水平，降低TLR4、磷酸化蛋白激酶p38、磷酸化c-Jun氨基端激酶和磷酸化胞外信号调节激酶蛋白的表达。MAPK磷酸酶-1是受乙酰化调节的MAPK通路负性调节因子，HDACIs可增强其对MAPK信号通路的负性调节作用，使MAPK失活，抑制下游炎症相关因子的表达。可见，NF-κB和MAPK活性均受到乙酰化的调节，HDACIs可通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB/MAPK信号通道发挥抗炎作用。

3.2调控微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是一类内源性非编码小RNA，长度为19～25个核苷酸，与靶基因信使RNA结合可促进其降解或阻止靶基因翻译，从而抑制靶基因表达[25]。部分miRNA在炎症反应中发挥着重要的调控作用[26]。目前研究较多的与促炎或抑炎作用相关的miRNA主要有miR-155、miR-146a、miR-132、miR-142、miR-302b等。与健康人群相比，脓毒症患者miR-155 水平显著升高，且miR-155水平与脓毒症严重程度呈正相关，高水平miR-155可诱导CD39+调节性T细胞的增殖，加重免疫抑制，加剧脓毒症免疫失衡[27]。Taganov等[28]发现，LPS刺激可诱导人单核细胞miR-146a的分泌增加，从而抑制炎症反应，其作用可能是miR-146a抑制IL-1受体相关激酶1和TNF受体相关因子6，进而抑制了NF-κB活性。对人体炎症反应过程中miRNA变化的研究发现，miR-146a与炎症反应密切相关，可用于感染与非感染全身炎症反应的鉴别[29]。研究证实，miR-146a参与了LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应的调节[30]。Liu等[31]研究发现，LPS刺激肺泡巨噬细胞后，miR-132的表达上调，可见miR-132可能通过增强胆碱能抗炎途径抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症。将miR-142激动剂预注射至CLP诱导脓毒症小鼠模型的研究发现，小鼠体内炎症反应减弱，IL-2和TNF-α分泌减少，且外周血CD4+T/CD8+T细胞比例显著提高；但若经CLP处理后立即给予miR-142激动剂，则上述作用消失，推测miR-142可能通过调节免疫微环境抑制CLP诱导的炎症反应[32]。

HDACIs与miRNA关系密切。Scott等[33]采用微阵列分析法观察HDACIs刺激乳腺癌细胞miRNAs表达变化的研究发现，HDACIs刺激后5个miRNA表达上调，22个miRNA表达下调，提示HDACIs可影响miRNA的表达。Jiang等[34]研究显示，TSA可通过提高衰老小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB与miR-146a启动子的结合使miR-146a的表达显著提高，进而减轻LPS诱导的炎症反应。Wang等[35]对骨关节炎成纤维样滑膜细胞的研究发现，HDACIs可显著提高miR-146a的表达，从而负向调节IL-1。因此，HDACIs可能通过miRNAs发挥其抗炎作用。

3.3抑制肺泡上皮细胞凋亡 肺泡上皮细胞凋亡是脓毒症肺损伤过程中肺泡细胞死亡的主要机制之一。细胞色素C是由线粒体释放的促凋亡蛋白，正常情况下存在于线粒体和细胞核内部，LPS刺激后，细胞色素C从线粒体内释放至胞质，激活胱天蛋白酶3，导致DNA上核酸酶切位点暴露，从而加速了氧自由基和核酸内切酶的破坏，最终导致DNA片段化，出现细胞凋亡。陈隆望等[17]研究发现，TSA可抑制脓毒症肺组织中凋亡相关蛋白细胞色素C、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9的表达，表明TSA可通过线粒体途径减轻脓毒症肺组织凋亡。Takebe等[36]研究也发现，CLP诱导败血症小鼠肺组织中HDAC1、HDAC2、HDAC3蛋白的水平降低，组蛋白H3、H4的乙酰化水平增高，广谱HDACIs干预可显著抑制肺和脾脏的细胞凋亡。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路在细胞存活和凋亡中起重要作用。对大鼠失血性休克模型的研究发现，HDACI可提高肾细胞蛋白激酶B的磷酸化水平，下调凋亡蛋白Bad蛋白的表达，表明HDACI可通过蛋白激酶B途径保护失血性休克大鼠肾细胞[37]。张力蛋白同源基因蛋白是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路的主要抑制性调节因子，HDACIs使张力蛋白同源基因蛋白过乙酰化，减弱其抑制作用，使蛋白激酶B活性增加，从而抑制细胞凋亡。

4 小 结

脓毒症致病因素复杂、感染部位不易明确、致病病原体类型繁多，导致治疗难度大，对人类健康构成巨大威胁。炎症和免疫反应失衡是脓毒症发生发展的主要机制，目前尚缺乏针对脓毒症发病机制的特异性药物，脓毒症治疗仍以抗感染为主。但是目前的研究结果表明，HDACIs可在基因转录水平对脓毒症发生发展过程中的炎症因子、炎症信号通道等进行调控，有望成为治疗脓毒症的新药物，其作用机制可能包括：①抑制TLR4-MyD88-NF-κB/MAPK信号通道，减少炎症因子的释放；②调控miRNAs转录水平，调节靶基因表达，抑制炎症介质产生；③抑制肺泡上皮细胞凋亡等。目前HDACIs在脓毒症治疗方面的研究尚处于起步阶段，相关研究多为细胞或动物实验，有效剂量能否安全用于人类尚不清楚。此外，目前应用的HDACIs多为广谱抑制剂，其作用机制较复杂，所致不良反应的程度尚不明确，故仍需进一步的研究。