葡萄酒酿造过程中不同工艺参数对生物胺含量的影响

王 瑞，董 荣，乔 丹，李 倩，张 轲，张珍珍

(新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052)

新疆光热资源丰富，昼夜温差大，十分适宜酿酒葡萄的生长，新疆与美国加州和法国波尔多并称为“世界上适宜葡萄栽培的三大黄金地区”，新疆的葡萄酒产业现已成为十分具有发展潜力的朝阳产业[1]。葡萄酒发酵过程中会产生甲醇、生物胺、杂醇油等发酵副产物，而这些发酵副产物会严重影响葡萄酒的品质和质量安全，危害人体健康[2-3]。生物胺是氨基酸脱羧或醛类物质由氨基酸转氨酶转氨作用而形成，其广泛存在于发酵食品中[4]。虽然生物胺在人体代谢过程中发挥着重要的作用，但它同时也会引起头痛、心悸等过敏反应[5-6]。生物胺在人体细胞中会被某些酶促代谢降解，但酒精会抑制这些酶的活性，使得脱毒效率降低。其中，组胺和酪胺被认为是对人体危害最大的生物胺，一些国家已经对葡萄酒中组胺含量做出了限定标准[7-9]，例如：澳大利亚、瑞士限量范围为≤10 mg/L，比利时为≤5～6 mg/L，法国为≤8 mg/L。腐胺和尸胺等虽然不能直接导致中毒，但它们能与其余几种生物胺协同作用，增强中毒症状。目前，生物胺的检测方法有多种多样，主要有生物传感器、毛细管电泳、薄层色谱以及高效液相色谱法等[10]。本实验以新疆地产的酿酒葡萄为试材，以酿造过程工艺参数为切入点，分析在葡萄酒酿造、贮存过程中各因素对生物胺产生积累的影响，阐明葡萄酒生产及贮存过程中生物胺形成的关键控制点。为控制新疆地产葡萄酒中生物胺的含量，消除葡萄酒潜在安全隐患，促进新疆传统葡萄酒行业得到健康发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2017年新疆玛纳斯地产赤霞珠葡萄(Cabernet Sauvignon)；丙酮、甲醇、色胺、苯乙胺、酪胺、组胺、腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、丹磺酰氯（均为色谱纯），美国Sigma公司；氯化钠、乙醚、氯仿、正丁醇（均为分析纯），南京化学试剂股份有限公司；酵母Ⅰ（L2323）、酵母Ⅱ（B0213）、酵母Ⅲ（RC212），乳酸菌Ⅰ、乳酸菌Ⅱ、乳酸菌Ⅲ，法国Lallemand公司。

1.2 仪器与设备

1200 Series高效液相色谱仪（high performance liquid chromatograph，HPLC），美国 Agilent公司；CT-6020A酸度计，深圳市柯迪达电子有限公司；PL303电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；D2155W离心机，美国Sigma公司；HS120210漩涡仪，美国Heathrow Vortexer公司；0.22 μm孔径有机相滤膜，上海安普科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄酒传统酿造工艺流程

原料→分选→除梗破碎→添加SO2→活化酵母→添加酵母→22～25℃酒精发酵→皮渣分离→10 d后澄清→取样→-40℃冷藏

1.3.2 样品前处理

向10 mL的葡萄酒样品中添加NaCl至饱和，待样品饱和后，取上清液5 mL置于离心管中。将其pH值调节为12后，加入5 mL正丁醇∶氯仿（1∶1，v/v）萃取并振荡，在3600 r/min的条件下离心10 min，吸取上层清液。重复萃取过程2次后量取3 mL萃取液，加入0.3 mL HCl（1 mol/L），振荡混合后氮气吹干，加入1 mL HCl（0.1 mol/L）溶解，样品待衍生。

1.3.3 生物胺标准溶液的配制

用0.1 mol/L的HCl将各生物胺标准品溶解，配制成浓度为100 mg/L的标准贮备液，液体保存于4℃条件下。将8种生物胺单组分标准贮备液各取1 mL，共同置于10 mL的容量瓶中，用0.1 mol/L HCl定容，配成生物胺混合标准溶液。最后分别移取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL上述溶液于10 mL容量瓶后定容，配制成质量浓度为1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L的标准溶液。

1.3.4 标准品及样品的衍生

取上述生物胺标准溶液0.5 mL，加入1 mL丹磺酰氯，1.5 mL饱和碳酸氢钠，60℃下避光反应30 min，再加入100 μL谷氨酸钠溶液混合均匀，60℃条件下反应15 min。反应结束后，各加入1 mL超纯水，混匀，40℃下氮气吹去丙酮。最后加入乙醚进行萃取，并重复萃取2次，合并乙醚萃取液，40℃条件下氮气吹干后，用1 mL色谱纯甲醇进行溶解，后将试样过0.22 μm滤膜，滤液待检测。样品衍生过程同上。

1.3.5 高效液相色谱条件

色谱条件：流动相A为甲醇，B为超纯水，梯度洗脱，C18色谱柱，柱温30 ℃，进样量为20 μL，检测波长254 nm，流速1.5 mL/min，洗脱程序见表1。

2 结果与分析

2.1 不同类型及接种量酵母对葡萄酒中生物胺含量的影响（图1）

在葡萄酒的酿造过程中酵母菌起着至关重要的作用，这其中不仅有野生酵母的参与，商业酵母更是广泛应用于酿造生产中[11]。本研究依照传统酿造工艺，研究比较3种不同商业酵母及接种量对葡萄酒中生物胺含量的影响，结果见图1。由图1可以看出，当接种不同类型酵母时，葡萄酒中生物胺含量存在明显差异，其中，当接种酵母Ⅰ时，葡萄酒中尸胺和亚精胺含量显著高于接种其他两种酵母的葡萄酒，在1%水平下差异极显著。而精胺、色胺和组胺含量则明显低于接种酵母Ⅱ和酵母Ⅲ，说明酵母对葡萄酒中生物胺的形成有一定的影响，且生物胺的形成较为复杂。当酵母类型相同，接种量不同时，葡萄酒中的生物胺含量也有差异。酵母接种量为400 mg/L时，除苯乙胺外，生物胺含量略高于接种量为200 mg/L酵母，但差异较小。说明酵母接种量对生物胺含量的影响小于酵母类型对生物胺含量的影响。

表1 梯度洗脱程序

图1 接种不同类型及接种量的酵母对葡萄酒中生物胺含量的影响

2.2 不同的发酵温度对葡萄酒中生物胺含量的影响（图2）

发酵温度影响着葡萄酒中微生物的生长繁殖，本部分主要研究了当发酵温度分别为18℃、22℃和26℃时对葡萄酒中生物胺含量的影响，结果见图2。由图2可知，葡萄酒中苯乙胺、色胺和精胺含量在发酵温度为22℃时较高。而腐胺、尸胺、组胺、酪胺和亚精胺含量则随着发酵温度的升高而减少，且不同发酵温度条件下，各生物胺含量在1%条件下差异不显著，说明葡萄酒酿造过程中发酵温度对生物胺含量的影响较小，不是影响生物胺含量的关键因素。

图2 不同的发酵温度对葡萄酒中生物胺含量的影响

2.3 不同类型乳酸菌及接种量对葡萄酒中生物胺含量的影响（图3）

乳酸菌是进行MLF的主要微生物，具有一定的氨基酸脱羧酶活性，有研究认为，乳酸菌会影响葡萄酒中的生物胺含量[12-14]。本研究主要对比了在相同发酵条件下，不同类型乳酸菌及接种量对葡萄酒中生物胺含量影响，结果见图3。由图3可以看出，乳酸菌类型对葡萄酒中生物胺含量有一定影响，当接种同类型的乳酸菌时，乳酸菌接种量越大，葡萄酒中生物胺含量越高。当接种10 mg/L乳酸菌时，葡萄酒中生物胺含量显著低于接种20 mg/L乳酸菌时的生物胺含量。同时，当接种同等量不同类型的乳酸菌，接种乳酸菌Ⅲ时，葡萄酒中生物胺含量较高。因为本研究采用的是相同基质的葡萄酒为样品，所以造成以上差异的原因可能是乳酸菌中氨基酸脱羧酶活性的差异。

图3 不同类型乳酸菌及接种量对葡萄酒中生物胺含量的影响

2.4 氨基酸脱羧酶对葡萄酒中生物胺含量的影响

辅酶5’磷酸吡哆醛是氨基酸脱羧酶的辅酶，能够增加氨基酸脱羧酶的活性[15]。为了进一步证明氨基酸脱羧酶活性对生物胺的影响，本实验以其中一个传统发酵工艺为空白对照组，另一个为处理样，即添加能提高氨基酸脱羧酶活力的辅酶5’磷酸吡哆醛0.05 g/L，结果见表2。由表2可看出，与空白对照组相比较，添加辅酶5’磷酸吡哆醛的葡萄酒中，生物胺含量有所提高，生物胺总含量由27.165 mg/L上升至29.061 mg/L，其中尸胺和腐胺含量上升的趋势最为明显，可以说明，氨基酸脱羧酶活性是影响生物胺含量的关键因素之一。

表2 氨基酸脱羧酶对葡萄酒中生物胺含量的影响 (mg/L)

图4 不同贮藏温度对葡萄酒中生物胺含量的影响

2.5 不同贮藏温度对葡萄酒中生物胺含量的影响（图4）

由图4可以看出，发酵结束后，随着贮藏温度的上升，葡萄酒中的8种生物胺含量也随之增加。其中，在贮藏温度为0℃和4℃时，葡萄酒中的精胺、亚精胺和色胺含量在5%和1%水平上均没有显著性差异，但当贮藏温度为22℃时，这3种生物胺的含量显著上升。说明贮藏温度在0℃和4℃时，温度对葡萄酒中这3种生物胺含量影响较小，但当贮藏温度上升到22℃时，温度对其含量的影响较大。苯乙胺和尸胺的含量则在3个贮藏温度条件下的差异均极显著，而组胺和腐胺含量则在3种贮藏温度下在5%和1%水平下均无显著差异。说明贮藏温度对葡萄酒中生物胺含量有一定的影响，在葡萄酒贮藏时，应避免贮藏温度过高，尽可能在低温条件下贮藏。

3 结论

本实验首先通过不同工艺参数（包括酵母类型及接种量、酒精发酵温度、乳酸菌类型及接种量、氨基酸脱羧酶活性和贮藏温度等）的酿酒试验，其次利用高效液相色谱法对葡萄酒中生物胺含量检测分析。结果表明，氨基酸脱羧酶的活性是影响生物胺含量的重要因素，接种不同类型酵母菌或乳酸菌时，对葡萄酒中的生物胺含量有一定的影响，但其接种量对生物胺含量的影响较小。在葡萄酒生产过程中可以通过生产工艺的调控，降低葡萄酒中的生物胺含量，以此保障和提升葡萄酒的食品安全性能。