miR-103和miR-107表达水平与变应性鼻炎患病风险、疾病严重程度和炎症水平的关联分析

熊 颖， 张 琼， 袁 琨

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一种发生在鼻黏膜的过敏性、炎症性疾病，在亚洲的患病率达到27%～32%[1-3]。同时，AR患者的鼻黏膜症状严重降低了患者的学习、工作和生活质量，更增加了患者患其他黏膜组织过敏性和炎症性疾病的风险，如哮喘和结膜炎[4]。由于环境恶化等其他因素的加重，AR的发病率仍在上升，且目前的药物治疗不能缓解约20%患者的症状。因此，寻找一个可靠的可用于辅助诊断和疾病监测的生物标志物十分紧迫[5-8]。近年来，微小RNA(microRNA，miR)被报道可以作为辅助AR诊断和预后的生物标志物[9-11]。miR-103和miR-107是位于10号染色体上的属于同一基因家族的miRNA，被发现在许多炎症疾病中发挥着抑制炎症并阻止疾病进展的作用，可以作为一些炎症疾病的风险和疾病监控标记物[12-13]。本研究旨在评估鼻黏膜组织miR-103和miR-107表达量与AR患病风险、疾病严重程度和炎症因子水平的关联。

1 对象与方法

1.1对象 选取2017年5月—2018年4月收治的80例AR患者。入选标准：(1)经病史、临床症状、鼻腔检查、皮肤点刺实验及血清变应原特异性IgE检测，根据文献[14]确诊的AR；(2)同意获取鼻黏膜组织；(3)4周内未接受抗组胺药物和糖皮质激素治疗。排除标准：(1)AR合并哮喘发作；(2)解剖学因素或其他因素造成鼻腔堵塞，包括严重的鼻中隔偏曲、鼻息肉和鼻窦炎等；(3)呼吸系统疾病，包括支气管哮喘、分泌性中耳炎等；(4)上呼吸道感染或其他严重感染；(5)合并恶性肿瘤；(6)孕妇或哺乳期妇女。入组的AR患者的年龄为(24.2±7.4)岁(10～41岁)，男性35例(43.8%)，女性45例(56.3%)，单个鼻症状评分(individual nasal symptom score，INSS)包括流涕、鼻痒、喷嚏、鼻塞评分分别为(1.9±0.7)分(1.0～3.0分)，(1.9±0.6)分(1.0～3.0分)，(2.3±0.7)分(1.0～3.0分)，(1.9±0.7)分(1.0～3.0分)，总鼻症状评分(totalnasalsymptomscore，TNSS)为(7.9±1.6)分(4.0～11.0分)；血清IgE水平中位值为270.7 IU/mL(四分位值：163.7～479.5)(30.6～1 318.1 IU/mL)。同期收集80例行鼻中隔偏曲手术矫正患者的鼻黏膜组织作为对照，所有对照组均无AR、哮喘史、呼吸道感染或其他严重感染、恶性肿瘤史。对照组年龄为(25.8±8.8)岁(5～48岁)(P>0.05)，其中男性40例(50.0%)、女性40例(50.0%)(P>0.05)，血清IgE水平中位值为22.4 IU/mL(四分位值：15.3～32.7)(5.8～59.0 IU/mL)(P<0.001)。本研究经伦理审查委员会批准，且所有受试者或其监护人均已签署知情同意书。

1.2AR严重程度评估 采用INSS和TNSS评估AR严重程度。INSS为患者自评，包括4种鼻症状评分，分别为流涕、鼻痒、喷嚏、鼻塞。每一种症状由患者根据以下标准进行评分：0分为无症状；1分为轻度症状；2分为中度症状；3分为重度症状。4种INSS之和即为TNSS[15]。

1.3组织标本收集 局部麻醉下取受试者下鼻甲前端黏膜组织，用无菌生理盐水漂洗、干燥后，置于冻存管中，放入液氮速冻，置于-80℃保存，待后续检测。

1.4miR-103，miR-107及炎症因子mRNA检测 采用RNeasy Protect Mini Kit(德国QiagenInc公司)试剂盒提取患者和对照组鼻黏膜组织中的总RNA，将总RNA采用ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix(日本Toyobo公司)逆转录为互补DNA(complementary DNA, cDNA)。采用THUNDERBIRD®SYBR®qPCR Mix(日本Toyobo公司)试剂盒进行聚合酶链式反应(poly merase chain reaction，PCR)。采用U6作为miR-103和miR-107的内参，采用NAPDH作为炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-13，IL-8，IL-10，IL-17mRNA的内参，最后通过2-△△ct公式计算miRNA和mRNA的相对表达量。定量PCR(quantitive PCR，qPCR)中采用的引物序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of the primers

miR:微小RNA； TNF-α：肿瘤坏死因子-α； IL：白细胞介素.

1.5样本量计算 本研究前期进行预试验。预试验中随机选取6例AR患者的鼻黏膜组织，并采集6例年龄和性别与患者相匹配、行鼻中隔偏曲手术矫正患者的鼻黏膜组织作为对照，采用qPCR检测miR-103及miR-107的相对表达量：miR-103在患者和对照组中的相对表达量分别为(0.525±0.370)，(1.809±1.020)；miR-107在患者和对照组中的相对表达量分别为(0.570±0.477)，(1.671±0.873)。取I类错误α=0.05，Ⅱ类错误β=0.1(把握度为90%)，以预试验中miR-103在患者和对照组中的相对表达量为估计值，进行差异性检验所需最小样本量为每组10例；以预试验中miR-107在患者和对照组中的相对表达量为估计值，进行差异性检验所需最小样本量为每组11例。为尽可能减少预试验中抽样误差对于样本量估计带来的偏倚，将研究样本量扩大到每组80例。

2 结 果

2.1miR-103/miR-107与AR患病风险的关联 miR-103在AR和对照组鼻黏膜组织的表达量中位值(1/4分位值～3/4分位值)分别为0.512(0.273～0.894)和0.990(0.554～2.438)；miR-107为0.462(0.265～0.726)和1.710(1.089～2.786)。AR患者的鼻黏膜组织miR-103和miR-107的表达量显著低于对照组，差别有统计学意义(P<0.001，图1A,B)。ROC曲线分析显示，鼻黏膜组织miR-103表达量可以在一定程度上预测AR的患病风险，其AUC为0.752(95%CI：0.678～0.826)(图1C)；鼻黏膜组织miR-107表达水平对AR患病风险具有较好的预测作用，其AUC为0.886(95%CI：0.834～0.939)(图1D)。通过计算特异性和敏感性的和，找到和最大处(最佳切割点)miR-103/miR-107的表达量，即为miR-103/miR-107的截断值，其中miR-103的截断值为0.797，其对于预测AR患病风险的敏感性为73.8%，特异性为65.0%；miR-107的截断值为1.007，其对于预测AR患病风险的敏感性为86.3%，特异性为81.3%。另外，AR患者和对照组鼻黏膜miR-103表达量和miR-107表达量均正相关(P<0.001，图1E，F)。

AR：变应性鼻炎. A：鼻黏膜miR-103在AR患者与对照组中的相对表达量； B：鼻黏膜miR-107在AR患者与对照组中的相对表达量； C：鼻黏膜miR-103相对表达水平对AR患病风险的ROC曲线； D：鼻黏膜miR-107相对表达水平对AR患病风险的ROC曲线； E：AR患者中鼻黏膜miR-103表达水平与miR-107表达水平的关联； F：对照组中鼻黏膜miR-103表达水平与miR-107表达水平的关联.图1 miR-103和miR-107与AR患病风险的关联Fig 1 The correlations of miR-103 and miR-107 with AR risk

2.2miR-103/miR-107与AR患者疾病严重程度的关联 AR患者鼻黏膜的miR-103表达量与鼻痒评分、鼻塞评分和TNSS均呈负相关(表2)，与鼻痒评分、鼻塞评分(P=0.001)和TNSS均呈负相关。将AR患者根据鼻黏膜的miR-103/miR-107表达水平截断值分为miR-103/miR-107高表达患者和miR-103/miR-107低表达患者，比较INSS和TNSS在两组间的差别，结果显示，miR-103低表达患者的鼻痒评分、鼻塞评分和TNSS显著高于miR-103高表达患者(P<0.05)，而流涕评分和喷嚏评分在miR-103低表达患者和miR-103高表达患者的差别无统计学意义(P>0.05，表3)。miR-107低表达患者和miR-107高表达患者间的流涕评分、鼻痒评分、喷嚏评分、鼻塞评分和TNSS比较，差别无统计学意义(P>0.05)。

表2AR患者中miR-103/miR-107相对表达量与疾病严重程度的关联
Tab 2The correlations of miR-103/miR-107 expression with disease severity in AR patients

项 目miR-103P值相关系数(r)miR-107P值相关系数(r)流涕评分0.9060.0130.179-0.152鼻痒评分<0.001-0.3990.022-0.256喷嚏评分0.152-0.1620.133-0.170鼻塞评分<0.001-0.4090.001-0.371TNSS<0.001-0.410<0.001-0.390

AR:变应性鼻炎； TNSS：总鼻症状评分.

表3疾病严重程度在miR-103/miR-107高表达和低表达患者中的差异
Tab 3The difference in disease severity between patients with miR-103/miR-107 high expression and patients with miR-103/miR-107 low expression

项 目miR-103高表达低表达miR-107高表达低表达流涕评分1.8±0.61.9±0.71.7±0.61.9±0.7鼻痒评分△1.6±0.72.0±0.51.6±0.71.9±0.5喷嚏评分2.1±0.92.3±0.62.1±0.92.3±0.7鼻塞评分△1.5±0.72.1±0.71.6±0.82.0±0.7TNSS△7.0±1.58.3±1.57.1±1.98.0±1.5

2.3miR-103/miR-107与AR患者炎症因子的关系 AR患者鼻黏膜的miR-103表达量与鼻黏膜TNF-α，IL-4，IL-6，IL-13，IL-17 mRNA表达量呈负相关，与IL-10表达水平呈正相关；miR-107表达量与TNF-α，IL-6，IL-8，IL-13，IL-17 mRNA表达水平呈负相关，与IL-10表达量呈正相关(表4)。对照组的miR-103表达水平与TNF-α，IL-4，IL-6，IL-8，IL-13，IL-17 mRNA表达量呈负相关，与TNF-α，IL-1β，IL-4，IL-8 mRNA呈负相关(表5)。

表4AR患者中miR-103/miR-107相对表达量与炎症因子mRNA的关联
Tab 4The correlations of miR-103/miR-107 expression with inflammatory cytokines mRNA levels in AR patients

项 目miR-103P值相关系数(r)miR-107P值相关系数(r)TNF-αmRNA<0.001-0.3970.003-0.331IL-1βmRNA0.123-0.1740.117-0.177IL-4mRNA0.025-0.2500.059-0.212IL-6mRNA0.001-0.3540.014-0.273IL-8mRNA0.064-0.2080.008-0.297IL-10mRNA0.0020.3400.0420.228IL-13mRNA0.005-0.3080.038-0.233IL-17mRNA<0.001-0.4070.005-0.312

AR：变应性鼻炎； TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素.

3 讨 论

本研究发现：(1)鼻黏膜miR-103和miR-107表达量在AR患者中低于对照组，且miR-103可在一定程度上预测AR的患病风险，miR-107对AR患病风险有较好的预测作用；miR-103和miR-107表达水平在AR患者中和对照组中均呈正相关；(2)AR患者miR-103和miR-107表达水平与AR疾病严重程度呈负相关；(3)AR患者miR-103和miR-107表达量与促炎因子水平呈负相关，与抑炎因子水平呈正相关。

表5对照组中miR-103/miR-107相对表达量与炎症因子mRNA的关联
Tab 5The correlations of miR-103/miR-107 expressions with inflammatory cytokines mRNA levels in controls

项 目miR-103P值相关系数(r)miR-107P值相关系数(r)TNF-αmRNA0.012-0.2790.014-0.275IL-1βmRNA0.124-0.1730.049-0.221IL-4mRNA0.025-0.2510.012-0.278IL-6mRNA0.040-0.2300.064-0.208IL-8mRNA0.015-0.2710.034-0.237IL-10mRNA0.1330.1700.3290.111IL-13mRNA0.012-0.2810.058-0.213IL-17mRNA0.076-0.2000.056-0.214

TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素.

miR-103被报道在与炎症相关的疾病中发挥促进疾病进展的作用。研究表明，miR-103可以通过调控Bcl2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirusE1B19 kDainteractingprotein，3BNIP3)减少人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中的氧化应激损伤，从而在心血管疾病中起到保护作用[13]。另一项实验表明，下调小鼠下丘脑miR-103表达水平显著升高了PI3K-Akt-mTOR通路的表达水平，导致小鼠发生食欲过盛型肥胖，增加了2型糖尿病的患病风险[16]。一项关于阿兹海默症(Alzheimer′s disease，AD)的细胞实验报道，miR-103在AD细胞模型中通过调控前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxidesynthase2，PTGS2)促进了神经细胞的生长，且抑制了神经细胞的凋亡和炎症，表明其在AD中发挥了保护作用[17]。这些研究表明，miR-103在与炎症相关的疾病中发挥抑制疾病进展的作用，包括通过调控多种蛋白以及信号通路减少氧化应激损伤、促进细胞生长、抑制细胞凋亡和细胞中的炎症反应等。本研究发现，鼻黏膜miR-103表达水平在AR患者中显著低于对照组，ROC曲线显示其可以在一定程度上预测AR的患病风险，且与疾病严重程度和炎症水平呈负相关，可能与miR-103在炎症相关疾病中的保护作用有关，如通过调控3BNIP3蛋白减少HUVEC中的氧化应激损伤等[13,16-17]。

miR-107与miR-103属于同一基因簇，且同样被发现在多种炎症相关的疾病中发挥着抑制炎症反应等保护作用[18]。研究表明，高压氧抑制了髓核细胞中HMGB1/RAGE信号相关通路并升高miR-107表达水平，从而减轻了炎症反应，在腰椎间盘退行性病变中发挥了治疗作用[19]。近期的体外实验表明，miR-107可以通过KRT1依赖的Notch信号通路减少在冠状动脉硬化小鼠血管内皮细胞中的炎症反应和内质网应激反应[12]。另一项研究表明，丙型肝炎病毒(hepatitis cvirus,HCV)可通过降低miR-107和miR-449的表达水平，靶向调控白介素6复合受体从而调控炎性因子CCL2，促进HCV患者肝脏组织中的炎症反应[20]。另外，有大鼠实验表明，丹参乙酸镁可通过调控miR-107/谷氨酸转运体1信号通路缓解缺血再灌注损伤，且体外实验结果显示，注射丹参乙酸镁可显著升高miR-107的表达水平[21]。以往的这些实验表明，miR-107是一个抑炎基因。本研究中，鼻黏膜miR-107在AR患者中显著低表达，且与疾病严重程度和炎症水平呈负相关，说明其在AR中或许发挥抑制疾病进展的作用，这个结果可能和以往研究发现的miR-107在多种疾病中通过调控多种通路或蛋白减轻炎症反应有关，包括：(1)通过调控多种信号通路减少细胞中的炎性反应；(2)通过调控相关通路减轻内质网应激反应；(3)通过调控炎性因子表达水平减轻炎症等[12,19-21]。另外，笔者还发现，在AR和对照组患者中，鼻黏膜miR-103和miR-107表达水平均呈显著正相关，或许表明miR-103/miR-107在AR中共同发挥着抑制疾病进展的作用。

本研究还存在一些缺陷：本研究纳入样本量较小，可能导致统计效能不足；作为一项单中心研究，大部分患者来自同一地区，造成了选择偏移；miR-103和miR-107在AR中的具体分子作用机制尚未研究。