miR-125a在支气管哮喘患儿血浆中的表达及其临床意义

董善武， 陈 勇， 夏丽红， 陈 玲， 何春枝

儿童支气管哮喘是儿童最常见的慢性气道疾病之一，其常见的临床症状包括反复发作的喘息、胸闷、气促和咳嗽等[1]。在中国，儿童支气管哮喘患病率高达3.02%，且呈现出逐年上升的趋势，给家庭和社会带来沉重的负担[2]。微小RNA(microRNA，miR)是一类只包含20余个核苷酸的单链非编码RNA，广泛存在于动植物及病毒中，并通过基因沉默等方式参与细胞生长、分化和凋亡等多种关键生命活动[3]。其中，miR-125a被发现可以调控包括中性粒细胞、巨噬细胞与调节性T细胞在内的多种免疫细胞活动及趋化因子和炎症介质的表达，并参与慢性阻塞性肺病、系统性红斑狼疮与克罗恩病等炎症性疾病的发生发展[4-10]。本研究旨在评估miR-125a在儿童支气管哮喘中的表达及其与疾病患病风险、急性发作风险、严重程度与炎症水平的关系。

1 对象与方法

1.1对象 连续纳入2017年1月—2018年6月就诊的急性发作期支气管哮喘患儿70例、缓解期支气管哮喘患儿70例。急性发作期支气管哮喘患儿纳入标准：(1)符合儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)中急性发作期支气管哮喘诊断标准；(2)年龄<16周岁。排除标准：(1)除呼吸道或肺部感染以外合并其他严重感染者；(2)合并恶性血液疾病或肿瘤者。缓解期支气管哮喘患儿入组标准：(1)符合儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)中支气管哮喘诊断标准；(2)经过治疗或未经治疗症状、体征消失，肺功能恢复到急性发作前水平，并维持3月以上；(3)年龄<16周岁。排除标准与急性发作期支气管哮喘患儿一致。同时，研究纳入70例于医院健康体检中心进行健康体检的儿童作为健康对照，入组标准：(1)年龄、性别、身高、体质量与入组支气管哮喘患儿相匹配；(2)无哮喘病史以及过敏性疾病史；(3)1月内未使用过免疫抑制剂或皮质激素类药物；(4)无感染、炎症性疾病、血液系统疾病或恶性肿瘤。入组急性发作期支气管哮喘患儿男性36例，女性34例，年龄(6.4±2.7)岁(2～14岁)，身高(116.2±16.8)cm(86～159 cm)，体质量(22.9±7.8)kg(11.2～45.2 kg)，有家族哮喘病史者20例(28.6%)；缓解期支气管哮喘患儿男性38例，女性32例，年龄(6.6±2.4)岁(3～14岁)，身高(117.3±15.7)cm(92～164 cm)，体质量(23.2±7.3)kg(13.2～53.8 kg)，有家族哮喘病史者16例(22.9%)；健康儿童男性42例，女性28例，年龄(7.4±2.6)岁(3～15岁)，身高(116.7±16.5)cm(92～166 cm)，体质量(23.4±7.9)kg(13.1～51.4 kg)，有家族哮喘病史者9例(12.9%)。3组受试者的年龄、性别、身高、体质量以及有家族哮喘病史者比例比较，差别均无统计学意义(P>0.05)。本研究已获得伦理审查委员会批准，入组前所有受试者法定监护人均已签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1资料收集 记录入组急性发作期支气管哮喘和缓解期支气管哮喘患儿的年龄、性别、身高、体质量、家族哮喘病史等基本信息，并收集其入院时实验室检测结果和肺通气功能检测结果，包括嗜酸性粒细胞水平、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平、第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in 1 second，FEV1)与用力肺活量(forced vital capacity，FVC)之比(FEV1/FVC)、FEV1实测/预测值百分比。同时，对于急性发作期支气管哮喘患儿，入院时的哮喘急性发作严重程度依据儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)进行评估并记录。对于入组的健康儿童在获得其法定监护人的书面知情同意后，收集其年龄、性别、身高、体质量、家族哮喘病史等基本信息，记录肺通气功能检测结果，并采集血液样本用以检测嗜酸性粒细胞水平、IgE水平及后续研究。

1.2.2血液样本采集和处理 采用抗凝管采集全血，1 h内离心分离血浆：离心机预冷至4 ℃，1 600 g离心10 min，吸取上清液，再次以4 ℃，16 000 g离心10 min。将血浆转移至冻存管中，置于-80 ℃保存，待后续检测。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)检测受试者血浆miR-125a相对表达量，并用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent sorbent assay，ELISA)试剂盒(美国Abcam公司)检测受试者血浆中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β，lL-1β)、IL-6和IL-17的水平。

1.2.3qPCR检测 采用TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)从患儿及健康儿童血浆样本中提取总RNA，并使用逆转录试剂盒(德国Qiagen公司)将RNA逆转录为cDNA。取逆转录产物为模板，使用miR-125a特异性引物进行实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)。并以U6作为miR-125a内参，采用2-△△Ct方法计算miR-125a 相对表达水平。引物序列如下：

miR-125a：

正向：5′-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′

反向：5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′U6：

正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′

反向：5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′

2 结 果

2.1miR-125a在3组受试者中的表达及其对3组受试者的区分作用 miR-125a在急性发作期支气管哮喘患儿中的表达水平[0.374(0.266～0.613)]显著低于缓解期支气管哮喘患儿[0.745(0.566～0.977)](P<0.001)和健康儿童[1.024(0.547～2.350)](P<0.001)，在缓解期支气管哮喘患儿中的表达水平亦显著低于健康儿童(P=0.022)(图1A)。ROC曲线表明，miR-125a可以分别区分急性发作期和缓解期支气管哮喘患儿(AUC：0.788，95%CI：0.710～0.866，图1B)、急性发作期支气管患儿和健康儿童(AUC：0.817，95%CI：0.749～0.885，图1C)以及缓解期支气管哮喘患儿和健康儿童(AUC：0.613，95%CI：0.516～0.709，图1D)。同时，miR-125a区分急性发作期和缓解期支气管哮喘患儿在最佳切割点(miR-125a表达量：0.496)的敏感性为67.1%，特异性为85.7%；miR-125a区分急性发作期支气管哮喘患儿和健康儿童在最佳切割点(miR-125a表达量：0.809)的敏感性为87.1%，特异性为61.4%；miR-125a区分缓解期支气管哮喘患儿和健康儿童在最佳切割点(miR-125a表达量：1.040)的敏感性为85.7%，特异性为50.0%。最佳切割点定义为敏感性和特异性之和达到最大时miR-125a的表达水平。

图1 miR-125a相对表达量在3组受试者中的差异Fig 1 miR-125a expressions and ROC curves

2.2急性发作期支气管哮喘患儿miR-125a表达水平与疾病严重程度的关联 miR-125a在轻度、中度和重度急性发作期支气管哮喘患儿中表达水平分别为0.705(0.547～1.453)、0.374(0.293～0.484)和0.199(0.102～0.278)，进一步分析发现，miR-125a的表达水平与急性发作严重程度呈显著负相关(P<0.001)。

2.3miR-125a表达水平与嗜酸性粒细胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1实测/预测值百分比的关联 在急性发作期支气管哮喘患儿中，miR-125a表达水平与FEV1/FVC(P<0.001，r=0.502)及FEV1实测/预测值百分比(P<0.001，r=0.510)呈显著正相关，与嗜酸性粒细胞(P=0.181，r=-0.162)和IgE(P=0.535，r=-0.075)无关；在缓解期支气管哮喘患儿和健康儿童中，miR-125a表达水平与嗜酸性粒细胞、IgE、FEV1/FVC和FEV1实测/预测值百分比无关(P>0.05,表1)。

2.4miR-125a表达水平与炎症因子的关联 在急性发作期支气管哮喘患儿中，miR-125a表达水平与TNF-α(P=0.005，r=-0.331)，IL-1β(P=0.007，r=-0.318)及IL-17(P=0.037，r=-0.250)水平呈显著负相关；在缓解期支气管哮喘患儿中，miR-125a表达水平与TNF-α(P=0.032，r=-0.256)及IL-17(P=0.001，r=-0.376)水平也呈显著负相关；在健康儿童中，miR-125a表达水平与IL-6(P=0.024，r=-0.269)及IL-17(P=0.026，r=-0.266)水平亦呈显著负相关(表2)。

表1miR-125a相对表达量与嗜酸性粒细胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1实测/预测值百分比的关联
Tab 1Association of miR-125a expression with eosinophil, IgE, FEV1/FVC and FEV1(actual)/FEV1(predicted) levels

项 目miR-125a相对表达量P值相关系数(r)急性发作期支气管哮喘患儿 嗜酸性粒细胞0.181-0.162 IgE0.535-0.075 FEV1/FVC<00010.502 FEV1实测/预测值百分比<00010.510缓解期支气管哮喘患儿 嗜酸性粒细胞0.233-0.145 IgE0.052-0.233 FEV1/FVC0.286-0.129 FEV1实测/预测值百分比0.698-0.047健康儿童 嗜酸性粒细胞0.0790.211 IgE0.5430.074 FEV1/FVC0.061-0.225 FEV1实测/预测值百分比0.878-0.019

IgE：免疫球蛋白E；FEV1：第1秒用力呼气容积；FVC：用力肺活量.

表2miR-125a相对表达量与炎症因子的关联
Tab 2Association of miR-125a expression with inflammatory factors

项 目miR-125a相对表达量P值相关系数r急性发作期支气管哮喘患儿 TNF-α0.005-0.331 IL-1β0.007-0.318 IL-60.089-0.205 IL-170.037-0.250缓解期支气管哮喘患儿 TNF-α0.032-0.256 IL-1β0.098-0.200 IL-60.061-0.225 IL-170.001-0.376健康儿童 TNF-α0.081-0.210 IL-1β0.077-0.213 IL-60.024-0.269 IL-170.026-0.266

TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素.

3 讨 论

本研究发现：(1)miR-125a在急性发作期支气管哮喘患儿中的表达水平显著低于缓解期支气管哮喘患儿与健康儿童，在缓解期支气管哮喘患儿中的表达水平亦显著低于健康儿童，ROC曲线提示miR-125a可以显著区分3组受试者。(2)miR-125a表达水平与急性发作期支气管患儿的疾病严重程度呈显著负相关，而与肺通气功能呈显著正相关。同时，miR-125a还与3组受试者炎症因子水平呈显著负相关。

miR作为一类重要的非编码RNA，其在各种疾病发病中的作用受到越来越多的关注和研究[11-12]。近几年来，有大量文献报道miR-125a广泛参与炎症活动[10,13-15]。Qin等发现，miR-125a可以通过调控粒细胞生长调节因子Socs3从而影响中性粒细胞的分化和浸润[16]。Pan等发现，miR-125a基因敲除的小鼠容易出现结肠炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎，且注射正常调节性T细胞后可以改善这些小鼠的症状，而注射miR-125a基因敲除的调节性T细胞后小鼠症状无明显改善，提示miR-125a通过调控调节性T细胞的活动从而抑制异常炎症活动[17]。Zhao等发现，miR-125a表达水平在系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞中显著低于健康对照者，且其可以下调趋化因子CCL5的表达，而后者可以募集淋巴细胞并激活自然杀伤细胞，表明miR-125a通过调控CCL5从而抑制系统性红斑狼疮患者体内异常的炎症活动[15,18]。同时，miR-125a在系统性红斑狼疮有肺部累及患者中的表达水平亦显著低于无肺部累及的患者，且其还可以抑制IL-16介导的中性粒细胞的募集，提示miR-125a通过抑制中性粒细胞活动从而缓解系统性红斑狼疮患者体内肺部炎症损伤[14]。在另一个研究中，Sun等发现，miR-125a在活动的克罗恩病患者中的表达水平显著低于非活动的克罗恩病患者及健康对照者，且其可以分别区分活动与非活动的克罗恩病患者及活动的克罗恩病患者和健康对照者。同时，miR-125a在活动的克罗恩病患者中的表达水平与急性期反应蛋白、红细胞沉降率、疾病活动指数、IL-17和TNF-α呈显著负相关[8]。以上研究表明，miR-125a通过调控多种炎症活动从而参与炎症性疾病的发生发展。

鉴于儿童支气管哮喘也是一种慢性炎症性疾病，并且在其发病过程中有包括嗜酸性粒细胞、T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞在内的多种炎症免疫细胞以及白介素、趋化因子和组胺等炎症介质参与，笔者推测，miR-125a与儿童支气管哮喘的患病和急性发作也密切相关[19]。本研究中，笔者发现miR-125a在急性发作期支气管哮喘患儿中的表达水平显著低于缓解期支气管哮喘患儿与健康儿童，在缓解期支气管哮喘患儿中的表达水平亦显著低于健康儿童，ROC曲线表明miR-125a可以显著区分这3组受试者，提示miR-125a对儿童支气管哮喘患病及急性发作具有预测价值。这与文献报道的miR-125a在系统性红斑狼疮及克罗恩病中显著低表达的结果一致[8,18]。同时，笔者还发现，miR-125a表达水平与急性发作期支气管患儿的疾病严重程度及所有3组受试者炎症因子水平呈显著负相关而与患儿肺通气功能呈显著正相关，表明miR-125a对儿童支气管哮喘疾病严重程度与炎症水平具有预测作用。可能的原因为miR-125a通过多种通路调控某些炎症免疫细胞(如调节性T细胞、IFN-γ+T细胞、IL-17+T细胞和中性粒细胞)的活动并下调炎症因子(如TNF-α、IL-6和IL-17等)的表达，缓解这些炎症因子带来的炎症损伤从而抑制儿童支气管哮喘患病及发作，而下调miR-125a表达水平则促进支气管哮喘的患病和急性发作，加重炎症活动，进而加重患儿疾病严重程度和炎症损伤。

本研究揭示了miR-125a在支气管哮喘患儿中的表达及其与儿童支气管哮喘患病、急性发作、严重程度与炎症水平的关系，对进一步探索miR-125a在儿童支气管哮喘和其他炎症性疾病中的作用及分子生物学机制奠定了基础。在本研究中，考虑到miR-125a在支气管黏膜中的表达水平不容易测定，因此测定的是miR-125a在血浆中的表达水平，而miR-125a在血浆中的水平可能受到多种因素影响，容易引入混杂偏倚。同时，该研究为中等样本量的单中心研究，因此需要后续更大样本的多中心研究进行验证。