尿外泌体与肾脏疾病相关性最新研究进展

吴志佳 张 瑞

南京医科大学康达学院，江苏省连云港市 222000

我国是尿毒症的高发国家，当肾脏疾病发展至终末期阶段，必定导致尿毒症。引起尿毒症的原因主要包括：原发性的或继发性的慢性肾小球肾炎走向慢性肾衰竭，糖尿病肾病以及膜性增生性肾病等也是引起尿毒症的原因之一。目前有遗传性的多囊肾也逐渐成为我国肾病高死亡率的原因之一。当肾脏发生病理上的坏死缺血及生理上的功能损伤是最先由尿液的性状特征、气味、颜色等方面表现出来。尿外泌体是一种细胞外囊泡，来源于肾脏和泌尿道的各种细胞释放的。当肾脏功能受损，及其肾小球、肾小管等结构的损伤，都会排泄相应的受损废物——囊泡状物质，所以外泌体是直接反应肾脏生理功能的最佳指标。通过尿液中尿外泌体成分的分析，通过定量指标检测，可以精确地确定肾脏受损的严重程度及其生理功能的状态，从而可以避免临床上侵入性诊断肾脏疾病。

1 尿外泌体

1.1 概述 外泌体是一种形似于含有大量的活性物质的囊泡状颗粒物，并且通过信号转导在细胞间传递遗传物质。20世纪80年代，通过在体外培养的绵羊红细胞培养液中， R.M.Johnstone[1]和Eberhard G.Trams这两位科学家初次发现了外泌体[2]。到2007年，Valadi发现并证实了外泌体中包含的mRNA以及microRNA具备良好的生物活性开发其研究价值。通过相关的研究实验，外泌体可以在人体的排泄物以及体内流动的血液和组织液中提取并分离出来。尿外泌体是由肾及泌尿道的相关器官中各种细胞合成并释放到尿液中的胞外囊泡，因此尿外泌体中含有的氨基酸及核酸物质可以作为衡量来源细胞生理状态的最佳指标。

1.2 尿外泌体的来源 除血液之外，尿液是另一种潜在的液体活检样本的来源。与血样相比，尿液的侵入性更小，安全性更高，易于操作得以保存。尿外泌体是来自肾脏或其他泌尿系统细胞分泌的包含蛋白质及核酸等物质的细胞外囊泡(EVs)，肾小管、肾小球、膀胱细胞及前列腺的尿外泌体中所包含的蛋白质及核酸物质，可作为肾脏疾病的生物学标志物，现阶段，研究人员通过分析蛋白质等组学成分，事实证明，几乎所有肾脏的先天细胞都能分泌外泌体，小鼠肾细胞的足细胞在电镜下可以看到多囊体和外泌体的存在[3]。随着研究视角的转变，小鼠的生殖道器官在电镜下也能观察到尿外泌体。有些尿外泌体是随着血液循环，最后流入肾脏，通过相关的肾小球滤过功能排泄到体外，也可以成为尿外泌体，但所占比例微乎其微。

1.3 尿外泌体的提取分离 曾有研究利用两步超速离心法，这是第一次从尿液中对尿外泌体进行了成功的分离提取，随着科学研究技术以及不断发展成熟的技术手段，近年来可通过超速离心法、超滤法、磁珠免疫法等分离尿外泌体，这些方法各有利弊，若想要同时确保分离所得的尿外泌体的纯度、产量及其生物活性的话到目前为止有一定难度，这也是实验后期我们亟须考虑解决的问题，使之尽可能达到最优化。至今，人们对如何收集纯化尿外泌体并无统一标准，超速离心法的使用较其他方法多一些，主要根据差速离心的原理进行操作，该法操作简单，依次清除体内的细胞，将残余的碎片清理干净，最后沉淀尿外泌体以到达收集纯化的效果，由于处理起来产量不足相对耗时等缺点，需定制一个既省时产量又多的提取方法，在其纯度及生物学活性上也需密切关注。

2 尿外泌体作为生物标志物的应用方面

大量研究表明，尿外泌体中的大量生物标记物与肾脏疾病相关，为了在大量人群中广泛筛查疾病，通过检验入院患者尿液中的蛋白质及核酸成分，据其成分组成推断来源器官的生理状态是否良好，判断来源器官的结构是否完整以及功能是否受到损伤破坏，目前已有大量新型生物标记物可以标记推断出相关肾脏疾病。

2.1 急性肾损伤 急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)是临床上常见的急性危重病，肾功能突然发生的(1～7d内)或持续(24h以上)下降，具有高死亡率特征的一种危重疾病[4]。临床病诊断标准为血清肌酐(Scr)升高的含量至少达到0.5mg/d，出现氮质血症、水电解质紊乱、酸碱平衡失调和一些其他的全身疾病症状。可伴有少尿(<400ml/24h或17ml/h)或无尿(<100ml/24h)，只有当肾小球滤过率降低 50% 以上时，血清肌酐浓度才有明显的上升现象，故临床上迫切需要能够提示早期肾功能下降的指标。AKI动物模型研究显示，在早期(6～48h)水通道蛋白-1与钠氢离子交换体[5]发生显著的下降，相较于传统的钠排泄指标分数而言，尿视黄醇结合蛋白有高度的敏感性和高特异性等优势。此外，在损伤早期(2～6h)，尿外泌体的胎球蛋白-A、转录活化因子[6]和足细胞的骨架巢蛋白表达程度较高，较常规操作的血肌酐酶，可提前(18～48h)发生显著的改变。

2.2 肾小管疾病 肾小管疾病(Renal tubular disorders)是指一组以肾小管功能障碍为主要特征的肾脏病变。该疾病的主要临床表现包括肾性糖尿病、低分子量蛋白尿、氨基酸尿或电解质紊乱及酸中毒，多种水转运蛋白和离子转运蛋白在尿外泌体中被发现，侧面可以反映出肾小管的生物转运活性的临床丰度，因此这些转运蛋白可作为评价肾小管功能的生物标志物。

2.3 多囊肾病 多囊肾病在临床上属于严重的遗传性肾脏疾病，多囊肾是由肾小管的变形扩张演变而来，又名Potter(Ⅰ)综合征。1941年，我国朱宪彝首次报道多囊肾病，多囊肾有两种类型，一种为常染色体显性遗传型，因其常在青中年时期发病，故又称为成年型。另一种与之相反，常染色体隐性遗传又称婴儿型，表现为双肾肿大，在小儿上由于缺乏表达及相关症状，所以在临床上很难被诊断出来，发病率为1∶1 000[7]，其发病机制与人体纤毛的发育异常密切相关。肾脏纤毛表达的多囊蛋白-1和多囊蛋白-2等其他囊蛋白共同参与形成囊蛋白复合体，肾小管受压后使得腔内水压上升，促进体内钙离子内流增加，将机械能刺激转变成化学信号，对生理性的左右不对称发育有引导作用。通过对尿外泌体的蛋白组独臂分析，在多囊肾病中可以检测到4种蛋白组的物质。最具有评估多囊肾病的预后价值的要数多囊蛋白与跨膜蛋白的相关性。因其具有遗传相关性，在怀孕期间通过检测PKD1或PKD2基因可有效降低新生儿缺陷率[8]。

2.4 肾小球疾病 肾小球足突细胞损伤状态时，肾母细胞瘤蛋白-1(Wilms tumor 1 protein，WT1)是肾脏发育的重要转录因子，尿外泌体是WT1内载有的生物标志物。WT1在局灶节段性肾小球硬化的动物模型中肾穿标本中表达有所上升，并早于蛋白尿出现[9]。Zhou 等在 FSGS 和塌陷性肾小球病两种动物模型中发现尿外泌体的 WT1 早于蛋白尿升高，且升高幅度更明显[10]，并可用来评估 ARB 类药物的治疗效果[11]。此外，尿外泌体 WT1 与早期 DN 患者的尿蛋白/血肌酐水平呈明显相关[12]，可作为 DN 早期肾功能的监测标志。另有研究通过定量分析患者尿外泌体中与肾脏的足细胞生理相关的基因从而达到区分微小病变和局灶节段性肾小球硬化的目的[13]。对Ⅰ型糖尿病合并早期DN 患者尿外泌体的 miRNA 进行表达差异分析，发现miR145 与对照组相比有显著的升高。为进一步提高检测的阳性率，通过高浓度碳水化合物刺激肾小球系膜细胞后，细胞中的 miR145 升高更加显著，暗示了miR145 可能成为1型糖尿病患者新的生物标记物，成为临床诊断的判断依据。

3 尿外泌体在相关肾脏疾病中的临床治疗

外泌体，一种普遍存在人体血液、尿液中的囊泡物质，不仅可以作为肾脏疾病诊断的相关性指标，同时外泌体也不断被挖掘在肾脏疾病治疗中的未来临床潜力。外泌体具有免疫作用、靶向运输作用以及保护修复三大作用[14]。

3.1 通过免疫作用的治疗应用 依据其免疫作用，在临床上已经得到较多的应用。分泌肿瘤细胞的外泌体可以促进肿瘤的生长与浸润，抑制肿瘤的特异性免疫以及免疫监视作用，但经研究发现，肿瘤外泌体包含了一种抗原，此抗原可抑制癌基因生长，促进主要组织相容性复合体的一类分子细胞增殖分化[15]，并促使T细胞依赖的同种异型肿瘤进行免疫防御。骨髓抑制细胞可以抑制T淋巴细胞的增殖与活化，在癌症的发展进程中，临床可应用MDSC对癌细胞进行标记抑制肿瘤细胞生长扩散，在Stat3磷酸化与其外泌体的Hsp70的共同作用下，MDSC外泌体中所包含抗原可以发挥抑制肿瘤生长的免疫作用[16]。在临床诊治中具有特异性，且靶向目标明确，将其应用于肾细胞癌相关的治疗中，无疑是一项新的治疗技术上的进步。

3.2 通过靶向运输作用的治疗应用 靶向运输作用需要一个通常稳定的内环境，内皮组织可维持血流通畅，血压稳定，不易发生凝血阻塞，利于血脂清除，因而成为外泌体主要靶点的首选。研究证明上皮组织释放一种叫促转录因子3(ATP3)的外泌体，在肾缺血再灌注损伤时可发挥巨大作用，该外泌体可抑制上皮细胞MCP-1的表达，抑制单核细胞促进蛋白-1的释放，抑制巨噬细胞向外周扩散破坏组织结构，从而肾缺血再灌时就不易发生大面积损伤甚至坏死，该种外泌体可针对肾缺血再灌注所造成的损伤进行有效保护及治疗[17]。

3.3 通过保护修复作用的治疗应用 外泌体作为间充质干细胞条件培养基的活性成分物质，其保护修复作用在临床应用中意义非凡，可保护肾缺血再灌注造成的损伤现象并对其进行修复作用，缩短肾脏功能的恢复时间，当组织发生炎症反应时，含转录激活因子3 的RNA外泌体可减弱炎症反应对机体造成的损伤，从而保护肾脏[18]。例如，在急性肾脏损伤时，外泌体通过旁分泌的作用，一方面减少肾脏的损伤程度，一方面也能提高肾脏缺损的修复速度。

目前运用到临床诊断肾病的主要依靠微蛋白、肌酐以及肾小球滤过率等测定。然而能够精确的诊断某一种肾病类型以及损伤程度只能依靠侵入性的穿刺做病理活检。尿外泌体在肾脏疾病方面有着得天独厚的优势。作为肾脏疾病发展的第一诊断指标，发现特异性的尿外泌体，通过对其筛查，必定可以作为疾病早期诊断的指标。目前，越来越多的实验研究证实了泌尿系统中尿外泌体的作用，对相关疾病的治疗将会成为新时期的一个研究热点。